[发明专利]一种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及水产动物遗传育种技术领域，更具体涉及一种鉴定转生长激素(growth hormone，GH，以下同)基因鱼纯合子的方法，还涉及纯合子转基因鱼在转基因鱼纯系建立和新品种培育中的应用。采用常规PCR和定量PCR(real-time PCR，以下同)相结合的技术，通过比较纯合子和半合子转基因鱼中转植基因整合的相对拷贝数，分析转植基因为阳性的转基因鱼的基因型，从而快速准确地鉴定出转基因鱼纯合子，对于建立转基因鱼纯系，加快转基因鱼新品种培育进程具有重要意义。

背景技术

从第一批快速生长的转基因鱼诞生迄今，世界范围内已成功研制了30多种转基因鱼，这些转基因鱼包含了世界水产养殖的许多重要品种，如：鲤鱼、罗非鱼、鲇类及鲑鳟鱼类等(Hu Wei and Zhu Zuoyan.Integration mechanisms of transgenes and population fitness of GH transgemc fish.Science in China Ser C-Life Sci，2010，53：401-408.)。采用转基因技术培育具有优良性状的养殖鱼类新品种，已成为水产养殖业可持续发展的主导性技术之一。

在转基因鱼群体中获得具有优良性状的转基因鱼后，通过转基因鱼自交从而产生纯合子转基因鱼，从转基因鱼自交群体中筛选出遗传性状稳定的纯合子转基因鱼后，就可以以纯合子转基因鱼为亲本建立转基因鱼家系，从而培育出性状优良、遗传稳定的养殖新品种。但是，转基因鱼自交群体由纯合子转基因鱼、半合子转基因鱼和同窝非转基因鱼组成，只有纯合子转基因鱼的性状才能在子代中稳定遗传，而不会出现性状分离现象。只有纯合子转基因鱼才可以作为候选的优良养殖新品种。因此，如何快速、准确地鉴定和筛选出纯合子转基因鱼是转基因鱼育种的关键之一。

采用Dot blot、Southern blot和半定量PCR分析转植基因整合的拷贝数后，再结合转基因鱼与对照鱼的测交结果分析，是筛选纯合子转基因鱼的常用方法，如在转基因罗非鱼和转基因泥鳅中的相关研究(Rahman，M.A.，Mak，R.，Ayad，H.，Smith，A.，Maclean，N.，1998.Expression of a novel piscine growth hormone gene results in growth enhancement in transgenic tilapia(Oreochromis niloticus).Transgenic Res 7，357-369；Martínez，R.，Arenal，A.，Estrada，M.P.，Herrera，F.，Huerta，V.，Vázquez，J.，Sánchez，T.，de la Fuente，J.，1999.Mendelian transmission，transgene dosage and growth phenotype in transgenic tilapia(Oreochromis hornorum)showing ectopic expression of homologous growth hormone.Aquaculture 173，271-283；Nam，Y.K.，Cho，Y.S.，Cho，H.J.，Kim，D.S.，2002.Accelerated growth performance and stable germ-line transmission in androgenetically derived homozygous transgenic mud loach，Misgurnus mizolepis.Aquaculture 209，257-270)。但是这些鉴定纯合子转基因鱼的方法不仅费时费力，而且所鉴定结果的稳定性不高。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鉴定转GH基因鱼纯合子的方法。该方法易行，操作简便，可以对转GH基因鱼自交群体中的纯合子和半合子转基因鱼进行准确、快速和高通量筛选。

本发明的另一目的是在于提供了一种纯合子转基因鱼在转基因鱼纯系建立和转基因鱼新品种培育中的应用。筛选到转基因鱼纯合子后，可以建立转基因鱼纯系，从而培育出养殖性状优良，遗传性状稳定的养殖鱼类新品种。本发明对于加快遗传性状稳定的转基因鱼新品种的培育进程具有重要意义。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：