[发明专利]一种组织工程人角膜基质载体支架及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于人角膜培养技术领域，具体涉及一种组织工程人角膜基质载体支架，即利用海水鱼类胶原蛋白制备的组织工程人角膜基质载体支架。

背景技术

人角膜基质层占角膜厚度的90％，主要由角膜基质细胞和胶原纤维等细胞外基质成分规则排列而成，透明且具有一定的曲率半径，有利于光线通过和折曲，在维持整个角膜的透明度和曲光率等方面具有至关重要的作用。角膜基质层一旦受到任何外伤或炎症破坏，通常会导致角膜水肿、不透明和瘢痕形成，由于角膜基质层中没有血管故而代谢缓慢，病理代谢产物很难完全去除，即使愈合后也会留下不同程度的混浊从而使视力受损，即角膜翳(corneal nebula)。绝大多数角膜基质病盲患者均可以通过角膜移植手术来治愈，但由于捐献角膜的高度匮乏致使绝大部分患者得不到供体角膜而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起及其快速发展，使组织工程人角膜基质的体外重建及其临床应用成为可能，也为角膜基质病盲患者通过组织工程人角膜基质的移植和重见光明创造了条件。

对组织工程人角膜基质的体外重建研究开始于上个世纪末，如何获得足量的人角膜基质细胞和生物相容性理想的载体支架是目前组织工程人角膜基质体外重建的研究热点。国内外学者们分别利用癌基因转染的永生化人角膜基质细胞和体外培养的人角膜基质细胞作为种子细胞，分别利用胶原蛋白-硫酸软骨素凝胶、胶原蛋白-聚N-异丙基丙烯酰胺共混聚合物、胶原蛋白-糖胺聚糖-壳聚糖泡沫、聚羟基乙酸未拆解纤维、水凝胶移植用透明人角膜片、多层胶原纤维、人角膜基质细胞分泌的细胞外基质和脱细胞猪角膜基质等作为载体支架，在体外成功重建出形态结构和透明度与正常角膜基质相似的人角膜基质类似物，为组织工程人角膜基质的体外重建开辟了道路。但由于所用种子细胞具有潜在致瘤性或数量有限，且所用载体支架与人角膜基质细胞的生物相容性不够理想，故而限制了组织工程人角膜基质的规模化体外重建及其临床应用，目前仍局限于实验研究，根本无法满足众多角膜基质病盲患者临床移植的需要。

2009年，樊廷俊等首次成功建立了1个未经任何癌基因转染、无致瘤的人角膜基质细胞系，成功解决了组织工程人角膜基质规模化体外重建缺乏足量种子细胞的问题。因此，尽早建立与人角膜基质种子细胞具有理想生物相容性的载体支架的规模化制备技术，已成为国内外学者开展组织工程人角膜基质体外重建研究的主攻目标，是全世界各种角膜基质异常相关患者重见光明的希望。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织工程人角膜基质载体支架，即一种海水鱼类胶原蛋白复合以硫酸软骨素制备出的与人角膜基质细胞生物相容性理想的载体支架，以及该支架的制备方法。

申请人在长期的研究中发现，以鱼类胶原蛋白为主要原料所制备出的胶原蛋白支架，更有利于人角膜基质细胞迁入且体内降解速率快，适于组织工程人角膜基质载体支架的规模化制备及其应用，从而促成了本发明。

本发明的组织工程人角膜基质载体支架，是以鱼皮胶原蛋白复合硫酸软骨素制备出的。

上述的组织工程人角膜基质载体支架中包含有质量百分比为20％-40％鱼皮胶原蛋白和60％-80％的硫酸软骨素。

上述支架的具体制备方法，包括如下的步骤：

1)将海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉溶解于盐酸中制成干粉溶液，离心过滤后加入到培养孔中冷冻干燥冻干；

2)将N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于2-吗啉乙磺酸-40％乙醇溶液中，制成NHS溶液，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液混匀制成交联剂溶液，最后加入硫酸软骨素，制成含硫酸软骨素的交联剂溶液；

3)向含有海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉的培养孔中加入含硫酸软骨素的交联剂溶液，于室温下交联处理后，用Na₂HPO₄溶液清洗稳定交联效果；再用NaCl溶液清洗去除交联剂；最后，用蒸馏水清洗冻干后完成支架的制备。

上述步骤1)中盐酸浓度为0.01M-0.02M，制成的干粉溶液的浓度为5mg/ml-10mg/ml。

为了提高胶原蛋白复合载体支架的韧性，在步骤1)的干粉溶液中又添加了质量百分比为0.05％-0.1％的IV型胶原蛋白。

为了进一步提高人角膜基质细胞在胶原蛋白复合载体支架上的贴附效果，步骤1)的干粉溶液中又添加了质量百分比0.05‰-0.1‰的纤连蛋白。

上述步骤2)中的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于50mM的2-吗啉乙磺酸-40％乙醇溶液中，制成6mM的N-羟基琥珀酰亚胺溶液；硫酸软骨素在含硫酸软骨素的交联剂溶液中的终浓度为2.4％-2.5％。