[发明专利]假单胞菌低温启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一个来源于低温假单胞菌启动子及其原核表达载体和应用。

背景技术

启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导RNA聚合酶同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。在微生物的异源蛋白表达中，启动子是影响异源表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。

当前，由于尚缺乏低温蛋白的高效表达系统，使得低温蛋白尤其是低温酶的生产远远不能满足科学研究及工业应用的需要。目前常用的蛋白表达系统多以大肠杆菌和酵母菌等中温菌作为宿主细胞，但由于大部分的低温酶热稳定性差，即使在中温宿主细胞中大量表达，也常会因热变性而失活。因此以嗜冷菌为宿主菌、以嗜冷菌启动子为启动子构建表达载体的方法越来越引起人们的重视。

低温启动子的研究属于刚刚起步阶段，目前仅有Duilio等人从分离自南极的海洋低温假交替单胞菌属菌株Pseudoalteromonashaloplanktis TAC125中，通过构建文库的方式，利用启动子探针质粒(Pseudoalteromonashaloplanktis TAC125为宿主细胞)，筛选到了能在4℃启动转录的低温启动子。对这些启动子的结构和功能的解析，为我们认识低温启动子在低温下启动的机制提供了生动的材料。

但是由于低温启动子的发展才刚刚起步，文献及资料相对较少，在当前还未形成完整的体系和理论。低温启动子在结构上不能与常温启动子明显区分开。一些具有低温启动活性的低温启动子的各功能调控区与常温启动子相同或相似。而还有一些具有低温启动活性的低温启动子则没有明显的保守结构序列，无法以常温启动子的保守序列为标准去确定其?10 区、?35区等低温启动子特定的各功能区及保守结构序列。因此大量分离低温启动子并分析其序列已成为当务之急。

此外，以低温菌为宿主细胞、利用来源于低温菌的启动子构建低温蛋白表达系统最近已有部分报道，研究表明在常温蛋白表达系统所难以表达的蛋白，包括来源于常温菌的甲苯、二甲苯单加氧酶，来源于人类的神经生长因子在这些表达系统中均获得了有效表达。尤其值得关注的是在低温蛋白表达系统表达的神经生长因子不但没有形成包涵体，而且准确定位于细胞的周质空间，充分体现了低温蛋白表达系统的优越性，为异源低温蛋白和常温蛋白的高效表达提供了新的有效方法，通过构建以低温菌为宿主的低温蛋白表达系统是解决高效、大量生产热不稳定蛋白质的一条可行之路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA分子，其来源于低温假单胞菌Pseudomonas sp. MY1402，并具有下列核苷酸序列之一：

a、具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

b、可与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列； 

c、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加、修饰的核苷酸序列；

d、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

本发明中所述DNA分子具有启动子活性，能够使目的基因在大肠杆菌和假单胞菌等原核细胞中表达，特别是在低温下能够高效表达。

本发明另一目的是提供一种原核表达载体，该载体含有前文所述的DNA分子。

本发明另一目的是提供一种原核宿主细胞，该细胞含有前文所述的DNA分子或原核表达载体。

本发明另一目的是将DNA分子应用于原核异源表达系统中。

本发明中所述原核异源表达系统为常温表达系统或低温表达系统。

在本发明中，将SEQ ID NO.1所示的启动子序列称为p1。

在本发明中，无启动子探针质粒称为pUE，将含有SEQ ID NO.1所示的启动子序列的探针质粒称为pUE1。

菌株Pseudomonas sp. MY1402由本实验室从梅里雪山明永冰川地区土样中分离得到。