[发明专利]一种高效表达鸡γ干扰素重组载体的构建及活性检测

说明书

技术领域  本发明涉及一种高效表达鸡γ干扰素重组载体的构建及活性检测，属于用分子生物学领域。

背景技术  干扰素(Interferon，IFN)是一类由T淋巴细胞和NK细胞产生的低分子可溶性多功能糖蛋白，能增强细胞毒性T细胞功能，促进B细胞分化和活化，诱导动物细胞产生多种抗病毒、抗肿瘤活性的细胞因子，具有良好的免疫调节作用(HOU Y-D.Molecular virology.Beijing：Xueyuan Press，1990.)。

鸡γ干扰素最早由Issaacs等于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时发现的，之后得益于生物技术的飞速发展，鸡γ干扰素的生物学研究进入到一个更为深入广泛的研究阶段。20世纪80年代初，人和许多哺乳动物干扰素基因也相继被克隆。近几年，Digby、Sick等国内外学者相继报道了鸡γ干扰素基因序列，在基因克隆、序列分析和体外重组表达等方面进行了大量的研究。已有的研究表明，鸡γ干扰素开放性阅读框有495个碱基，编码19个氨基酸的信号肽和145个氨基酸的成熟蛋白。鸡γ干扰素对某些病毒(腺病毒，流感病毒，水疱性口炎病毒等)的生长及繁殖有较强的抑制作用，可作为一种活化机体细胞的抗病毒生物制剂，同时也可作为免疫佐剂提高疫苗的保护效力(Kaiser P，Wain H M，Rothwell L.Structure of the chicken interferon-γ gene and comparison to mammalian homologues.Gene，1998，207(1)：25-32；Digby M R，Lowenthal J W.Cloning and expression of the chicken interferon-gamma gene.J IFN Cyto Res，1995，15：939-945；Weining K C，Schultz U，Munster U，et al.Biological properties of recombinant chicken interferon-gamma.Eur J Immunol.1996，26：2440-2447；Michalski W P，Shiell B J，ONeil TE，et al.Recombinant chicken IFN-gamma expressed in E.coli：analysis of C-terminal truncation and effect on biologic activity.J IFN Cyto Res，1999，19：383-392；Yeh H Y，Winslow B J，Junker D E，et al.In vitro effects of recombinant chicken interferon-gamma on immune cells.J IFN Cyto Res，1999，19：687-691)。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效表达鸡γ干扰素重组载体的构建及活性检测，以求在大规模工业化生产中能生产出高效、安全、价廉的鸡γ干扰素蛋白。

主要包括设计合成了鸡γ干扰素蛋白的基因，分析了蛋白表达调控元件、启动子的基因结构和相互关系，选择扩增包含T7启动子及相关调控元件、鸡γ干扰素基因及T7终止子在内的基因片段，作为鸡γ干扰素的表达盒并对其进行了部分基因改造，扩增得到的表达盒命名为T7 CHIF；选择原核表达载体pET-28a质粒的基因片段作为重组载体质粒的复制元件，包含pBR322 origin、kan抗性基因、f1 origin等基因，构建了带有该基因的单拷贝表达载体28a-T7CHIF。

本发明设计合成了能表达鸡γ干扰素蛋白的基因，这种基因含有如下核苷酸序列(序列1)：