[发明专利]基于荧光共振能量转移对水溶液中汞离子和/或银离子同时进行检测的方法

权利要求书

1.一种基于荧光共振能量转移来同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法，其特征在于：

（一）检测探针的制备

（1）巯基丙酸MPA包裹的碲化镉CdTe量子点的制备

将硼氢化钠NaBH₄、超纯水与碲Te粉一起混合在反应容器中，使NaBH₄的浓度为2-3M，Te粉含量为0.5-0.6M，再将反应容器置于0℃冰水浴中反应12h以制备澄清的NaHTe溶液备用；称取一定量的无机镉盐Cd²⁺溶解于水中，控制Cd²⁺浓度为0.01-0.02M，在剧烈的搅拌下滴加适量的MPA，用NaOH溶液调节pH为11.20，通N₂除氧、保护30min后迅速加入NaHTe溶液，维持Cd²⁺:Te^2-: MPA的摩尔比为1: 0.4-0.5: 2.2-2.5；反应后即得到CdTe量子点的前驱体溶液；取前驱体溶液加到以聚四氟乙烯作内衬的不锈钢反应釜中，160℃下反应20min，即得到所需要的CdTe量子点；

（2）检测用的核酸探针的设计与合成

氨基修饰过的单链核酸探针DNA1: 5'-NH₂-GTACAAGATG-3'；

未作任何修饰的单链核酸探针DNA2: 5'-GAGCTTTTCA GACGCATCTT GTACGACTCG CTCCCCATAC-3'；

荧光染料TAMRA修饰过的单链核酸探针TAMRA-DNA: 5'-TAMRA-TTTTGCTC-3'； 

吲哚类菁染料Cy5修饰过的单链核酸探针Cy5-DNA: 5'-Cy5-GTATCCCC-3'；

（3）量子点与核酸的荧光探针CdTe-DNA的制备

首先制备CdTe与DNA1的耦联物：把1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺EDC，N-羟基琥珀酰亚胺NHS与CdTe溶液按适当的比例混合到一起，活化0.5-1 h，然后加入DNA1 水溶液，在25℃下反应4h，进行超滤以彻底去除未与CdTe耦联的DNA1，即制备得到CdTe -DNA1；然后，把CdTe -DNA1与DNA2在室温下进行杂交反应6h，超滤以去除未杂交的DNA2，即制备得到量子点与DNA的探针CdTe -DNA1-DNA2；最后，把 Cy5-DNA与TAMRA-DNA的水溶液分别加到上述制备的CdTe -DNA1-DNA2中，即制备得到检测用的CdTe-DNA荧光探针；

（二）重金属离子Ag⁺和/或Hg²⁺的检测

（1）Ag⁺ 的检测

银离子与3-(N-吗啉)丙烷磺酸MOPS之间的键合力很弱，所以选择MOPS缓冲液作为检测体系：100nM 步骤（一）中制备的CdTe -DNA荧光探针，10mM 磷酸二氢钠/磷酸氢二钠NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、20mM的MOPS、50mM的硝酸钠NaNO₃；

将含有0-50 nM不同浓度银离子的水溶液加入到上述检测体系中，并在25℃下维持0.5h，使Ag⁺诱导的Cy5-DNA与DNA2杂交反应完全进行，然后测得整个体系的荧光发射图谱；

（2）Hg²⁺ 的检测

检测方法与步骤（1）类似，只是将步骤（1）中Ag⁺离子溶液换成Hg²⁺溶液；含有0-50 nM不同浓度Hg²⁺离子的水溶液加入到上述检测体系中，并在25℃下维持0.5h，使Hg²⁺ 诱导的TAMRA-DNA与DNA2杂交反应完全进行，然后测量整个体系的荧光发射图谱；

（3）同时进行Ag⁺ 和 Hg²⁺ 的检测

检测方法与步骤（1）类似，只是将步骤（1）中Ag⁺离子溶液换成Ag⁺ 和 Hg²⁺ 的混合溶液；含有0-50 nM不同浓度Ag⁺ 和 Hg²⁺ 的水溶液加入到上述检测体系中，并在25℃下维持0.5h，使Hg²⁺ 诱导的TAMRA-DNA与DNA2杂交反应和Ag⁺诱导的Cy5-DNA与DNA2杂交反应完全进行，然后测量整个体系的荧光发射图谱。

2.根据权利要求1所述的一种基于荧光共振能量转移来同时检测水溶液中二价汞离子和银离子的方法，其特征在于：量子点与核酸的荧光探针CdTe-DNA的制备：首先是制备CdTe与DNA1的耦联物：把320μL 0.1mM 的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺EDC，200μL 0.0125 mM的N-羟基琥珀酰亚胺NHS与1280μL 1μM CdTe溶液混合到一起，活化0.5-1 h；然后加入100μL 10μM的DNA1 水溶液，在25℃下反应4小时；然后用超滤膜以5000rpm 进行超滤15min，并用超纯水重悬，再次超滤，如此循环3次，彻底去除未与CdTe耦联的DNA1，即制备得到CdTe -DNA1；

然后，把900μL 1μM的CdTe-DNA1与100μL 20μM DNA2在室温下进行杂交反应6h，进行同样的超滤步骤去除未杂交的DNA2，即制备得到CdTe-DNA1-DNA2；

最后，把100μL 20μM Cy5-DNA 与100μL 20μM TAMRA-DNA的水溶液分别加到上述制备的CdTe-DNA1-DNA2中，即制备得到检测用的CdTe-DNA荧光探针。