[发明专利]抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及甲肝病毒的免疫学检测，具体地说，涉及抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒。 

背景技术

甲型肝炎病毒(HAV)是感染人类甲型肝炎的主要病原。主要是经粪口传播途径感染，即由病人的潜伏期或急性期粪便、血液中的甲肝病毒污染水源、食物、用具及生活密切接触经口进入胃肠道而传播。儿童和青少年人群多发。HAV感染的诊断依据是检出HAV的抗体。当前，抗-HAV IgM是早期诊断甲型肝炎的特异性较高的指标，且有简便，快速的优点。抗-HAV IgM在发病后1周左右即可在血清中测出。因此，可以通过检测抗-HAV IgM来建立诊断甲型肝炎的诊断方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一种抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒。 

为了实现本发明目的，本发明的一种抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒，其包括供体微珠、受体微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原，其中，所述供体微珠包被有含25mM HEPES、100mM NaCl和0.05％ Proclin-300，pH7.2的链霉亲和素溶液；所述受体微珠包被有含0.05％ Proclin-300，pH7.2的Anti-IgM的PBS溶液。 

前述的试剂盒，包括供体微珠20μg/ml、受体微珠5μg/ml以及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6×10^-8ng/孔；使用时，以总体系10μl计，每孔添加量为：受体微珠4μl、供体微珠5μl、生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6×10^-8ng及血清1μl。 

前述抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒的制备方法，其 是将含25mM HEPES、100mM NaCl和0.05％ Proclin-300，pH7.2的链霉亲和素溶液包被至供体微珠上；将含0.05％ Proclin-300，pH7.2的Anti-IgM的PBS溶液包被至受体微珠上；生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制备过程为：用甲肝病毒TZ84株感染人胚肺二倍体细胞2BS株，培养细胞至病毒增殖高峰期，14天后收获细胞悬液，经氯仿抽提、PEG沉淀、离心后，用β-丙内酯灭活，浓缩后即得甲肝病毒TZ84株抗原，最后对得到的甲肝病毒TZ84株抗原进行生物素化。 

具体地，生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制备方法包括以下步骤： 

(1)将甲肝病毒TZ84株接种到人胚肺二倍体细胞2BS株中，培养至病毒增殖高峰期； 

(2)14天后收获的感染细胞悬液经冻融、超声各3次释放病毒； 

(3)进行氯仿抽提，10％聚乙二醇浓缩，8000r/min，4℃离心1h； 

(4)用含2％SDS的Tris-NaCl缓冲液悬浮沉淀，经蔗糖/甘油不连续密度梯度离心，从底层收获甲肝病毒抗原；其中，蔗糖/甘油不连续密度梯度为0.5ml 80％甘油，1.8ml 30％蔗糖，1.8ml 20％蔗糖，1.8ml10％蔗糖，1％SDS；离心条件为18℃，37000r/min，6h； 

(5)用β-丙内酯灭活甲肝病毒抗原后，进行超速离心浓缩； 

(6)对步骤(5)中得到的甲肝病毒抗原进行生物素化，具体为： 

(i)加入100μlWS缓冲液和60μl约123μg的浓缩甲肝病毒抗原到超滤管中； 

(ii)离心1000g，10min； 

(iii)将10μl二甲基亚砜加入到装有NH₂-reactive biotin的管中，用移液器吹打混匀； 

(iv)加入100μl反应缓冲液和8μl NH₂-reactive biotin到超滤管中，用移液器吹打混匀，37℃孵育30min； 

(v)加100μl WS缓冲液到超滤管中，离心10000g，10min，弃 滤液； 

(vi)加200μl WS缓冲液到超滤管中，离心10000g，10min，重复此步骤一次； 

(vii)加入200μl WS缓冲液，用枪头吹打10至15次，重悬此结合物； 

(viii)分装于200μl PCR中，加等量甘油，-20℃保存。 

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：