[发明专利]一种测定水中叶绿素a的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定水中叶绿素a的方法。

背景技术

目前水体中叶绿素的测定方法主要有国家环境保护局公布的《水和废水监测分析方法》(第四版)中推荐的丙酮研磨法测定叶绿素a，该方法是用醋酸纤维滤膜过滤水样，截留藻类的滤膜低温干燥6～8h后，加90％丙酮反复研磨提取，离心，用分光光计测定并计算chla含量。该方法缺点是①反复研磨提取中，叶绿素暴露在环境中，易发生光解；②丙酮易溶解乙酸显微滤膜，使滤膜上的叶绿素a粘滞于研磨器具；③丙酮对人体有毒，且挥发性强，对工作人员身体健康不利；④在反复添加溶剂和反复转移中，溶剂易粘与研磨器壁上，造成叶绿素的流失。

中国专利文献CN1631117公开了一种叶绿素a的测定方法，即乙醇研磨法。该方法是用0.8um的醋酸纤维滤膜过滤水样，用90％乙醇浸泡研磨，离心萃取，用分光光度法测定chla，该方法使用90％乙醇代替丙酮，增加了方法的安全性，但也有不足之处：①仍然需要研磨，过程繁琐，叶绿素易流失；②使用0.8um的滤膜，孔径过大，会使部分藻类无所截留而流失。

文献《乙醇法测定浮游植物叶绿素a含量的讨论》中使用了乙醇冷冻法，该方法是用0.45μm醋酸纤维滤膜过滤水样，用90％乙醇冷冻浸泡截留有藻细胞的滤膜12h，之后离心萃取，用分光光度法分酸化前和酸化后两步测定水样在665nm和750nm处得吸光度值，根据公式计算。该方法优点是使用乙醇做萃取剂安全性高，并且不需要研磨；缺点是需要盐酸酸化，盐酸使用量不好控制，重现性差。

发明内容

本发明是要解决现有的乙醇冷冻法测定叶绿素a的方法需要盐酸酸化，盐酸使用量不好控制，导致测定稳定性差、重现性差的问题，提供一种测定水中叶绿素a的方法。

本发明测定水中叶绿素a的方法，按以下步骤进行：

一、取50～200ml水样，采用0.45μm醋酸纤维滤膜进行过滤，真空泵压力控制在0.05MPa，获得截留有藻细胞的滤膜；二、将截留有藻细胞的滤膜剪碎放入装有6ml体积浓度为90％的乙醇溶液的离心管中，置于4℃冷藏12～24h；三、然后将离心管于8000r/min离心15min，收集上清液，再向离心管中补加4ml体积浓度为90％的乙醇溶液，再于8000r/min离心5min，收集上清液，合并两次离心获得的上清液，并加入质量浓度为90％的乙醇溶液定容至10ml，得萃取液；四、将萃取液于8000r/min离心5min，得萃取液上清液，以质量浓度为90％的乙醇溶液做参比，用分光光度计测定萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和750nm波长下的吸光度值，按以下公式计算水体中叶绿素a的含量：Chla＝[12.12(D664-D750)-1.58(D647-D750)-0.08(D630-D750)]Ve/V；其中Chla为水样中叶绿素a的含量，μg/L；D630、D647、D664和D750分别为萃取液上清液在630nm、647nm、664nm和750nm波长下的吸光度值；Ve为萃取液的总体积，ml；V为抽滤的水样体积，L。

本发明无需研磨，可大大节省人力，并避免因转移萃取液而造成的叶绿素损失；本发明使用乙醇作为萃取液，对人体安全无毒害；测定步骤不需要盐酸酸化，因此不受盐酸酸化程度的影响；提取更完全，结果重现性好。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式测定水中叶绿素a的方法，按以下步骤进行：