[发明专利]中国鲎C因子原核及昆虫杆状病毒重组表达载体的构建

权利要求书

1.中国鲎C因子基因，其特征在于由SEQ ID No.1序列所示，其中基因序列由3057bp组成；用于克隆的引物两端分别含有NcoI和NotI酶切位点；C端不含终止密码子。

2.中国鲎C因子基因，其特征在于由SEQ ID No.1序列所示，其中基因序列由3057bp组成；用于克隆的引物两端分别含有NcoI和NotI酶切位点；C端含终止密码子。

3.按权利要求1所述的中国鲎C因子(TtFC)基因克隆到原核表达载体中，其特征在于：采用引物如下，下划线为对应的酶切位点，大写序列对应中国鲎C因子基因末端序列，

F1：5’-cat gCC ATG GTCTTA GCG TCG-3’

R1：5’-aag gaa aaa agc ggc cgc AAT GAA CTG CCT AAT C-3’

以中国鲎血细胞总cDNA或中国鲎C因子DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增得到具有序列SEQ ID No.1中的碱基序列。

4.按权利要求1中所述的中国鲎C因子基因的制备方法，其特征在于聚合酶链式反应的PCR体系：

F1：100pmol，R1：100pmol，dNTPs：各50pmol，5×Prime star DNA聚合酶buffer：10μl，Prime star DNA聚合酶：5U，无菌水补足至50μl；

PCR反应条件：将上述PCR反应体系混匀，第一阶段95℃预变性3min；第二阶段95℃，1min；54℃，1min；72℃，3min20s；共进行30个循环；第三阶段72℃延伸10min。

5.按权利要求1所述的中国鲎C因子基因克隆到原核表达载体中，其特征在于：

采用引物如下，下划线为对应的酶切位点，方框为对应的终止密码子，大写序列对应中国鲎C因子基因末端序列，

F1：5’-cat gcc ATG GTCTTA GCG TCG-3’

R2：5’-aag gaa aaa agc ggc cgcAAT GAA CTG CCT AAT C-3’

以中国鲎血细胞总cDNA或中国鲎C因子DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增得到具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。

6.按权利要求1所述的中国鲎C因子基因在昆虫细胞表达的杆状病毒表达载体的质粒构建，其特征在于：

a)取1μg所述的中国鲎C因子的PCR回收产物与杆状病毒表达载体pFASTBacHTA分别在含有内切酶NcoI和NotI的反应体系中进行双酶切，37℃酶切1个小时；PCR产物双酶切后在65℃灭活15min，然后回收备用，pFASTBacHTA载体双酶切后进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后割胶回收备用；

b)按分子摩尔数之比1∶3取双酶切回收后所得的pFASTBacHTA和C因子的DNA，加入等体积的快速DNA连接酶，混合后将其在22℃连接0.5小时；其中，连接反应体系为20μl；

c)连接产物转化200μl大肠杆菌Top10感受态细胞，然后将转化后的产物均匀涂在含有50μg/ml的Ampicillin的LB固体培养基上，在37℃培养12小时；

d)挑平板上的单克隆菌落作为模板，PCR鉴定阳性克隆；

将阳性克隆培养后，抽提质粒，测序鉴定插入序列的正确性。