[发明专利]检测结核分枝杆菌分泌蛋白的免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于临床微生物快速检测的免疫层析技术领域，特别是涉及一种利用抗CFP-10蛋白抗体相关的免疫层析显色来早期鉴定培养物中结核分枝杆菌的方法。

背景技术

据世界卫生组织统计，全球已有近1/3的人口感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80％，其中约5％-10％携带者可发展为活动性结核病。我国结核病人数居全球第二位，每年死于结核病的人是各类传染病死亡人数总和的两倍多。近二十年由于艾滋病的流行，感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)的结核分枝杆菌携带者发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30-50倍。结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，更是影响我国发展的重大社会和经济问题。

结核病的实验室诊断主要依赖细菌学涂片和培养检查。由于方法所限，严重影响了结核病的及时诊断。因此，多年来国内外学者一直在寻找快速、敏感、特异、简便的实验室诊断方法。

结核分枝杆菌培养分离是目前结核病诊断的金标准，但使用普通罗氏培养基需要4-8周时间，改良酸性罗-琼氏培养平均也需要25天，无法充分满足临床快速诊断的需要。针对结核分枝杆菌的快速培养，目前出现了各种改良的液体培养基和自动培养系统(马俊，王自立.结核分枝杆菌快速培养的研究进展及其临床意义[J].中国脊柱脊髓杂志，2007，17(5).388-390)。液体变色培养基最先由德国Heipha/Biotest公司研制，称为MBRedox系统；自动培养系统包括以Bactec MGIT 960为代表的第二代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统以及BBL MGIT分枝杆菌快速手工培养、鉴定、药敏检测系统等。不管是液体培养基还是自动培养系统，都还存在污染率高的问题，对于仪器判断为阳性的样品，仍须进行涂片、抗酸染色、显微镜下找到抗酸杆菌后方能判定阳性，费事费力。自动培养系统更由于仪器和试剂价格昂贵，难以得到普及。因此研究开发新一代结核分枝杆菌的快速检测试剂非常必要。

结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)是Berthet等鉴定出来的一种低分子量、高度特异性的分泌性蛋白(BehrM A，Wilson M A，GillW P，et al.Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray[J].Science，1999，284(5419)：1520-1523.)，又名MTBb11、MTSA-10，位于结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)基因的上游，由同一个操纵子和启动子调节转录，属于ESAT-6家族蛋白，两者约40％的同源性，具有相同的免疫学特性。CFP-10存在于MTB的早期培养滤液里，仅分布于各型结核杆菌中，而BCG及其它非致病性分枝杆菌缺失。因此在诊断结核杆菌感染的过程中可以区别是结核分枝杆菌感染还是非致病性结核分支杆菌感染。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种使用简便快捷、灵敏度和特异性高、适合于基层现场快速检测培养物中结核分枝杆菌的免疫层析试纸。

为了解决上述问题，本发明提供一种快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸(双抗体夹心法快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸)，包括上样垫、含有金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6的胶体金垫、包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜吸样垫以及以及支撑板；检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗CFP-10单克隆抗体TBCD6，质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜的上表面分别设置胶体金垫和吸样垫，上样垫位于胶体金垫的上表面，硝酸纤维素膜的下表面与支撑板紧密相连。

本发明还同时提供了上述免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：

A、抗CFP-10单克隆抗体TBCD6和TBCA6的制备：

用于包被检测线的抗CFP-10单克隆抗体TBCD6，能特异性识别CFP-10的aa 23-36GDLKTQIDQVESTA抗原肽序列，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：C201082；

用于胶体金垫中金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6，能特异性识别CFP-10的aa53-66AAVVRFQEAANKQK抗原肽序列，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201083；

制备方法如下：