[发明专利]抑制发芽/生根的大麦成熟胚组织培养法及所用培养基

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种有效抑制发芽的大麦成熟胚组织培养方法及相应的组织培养体系。

背景技术

大麦组织培养不仅是大麦品种改良的有效途径，也是进行大麦遗传转化的重要环节。目前，大麦组织培养成功的外植体包括顶端分生组织、花药、幼胚和成熟胚等。其中，幼胚被认为是最理想的外植体材料，愈伤诱导率和植株再生率都比较高，获得转基因大麦的报道基本以幼胚为受体。而大麦幼胚取材受时间、空间和季节等的限制，合适的取材时期难以把握，在一定程度上制约了转基因大麦的有效开展与应用。

大麦成熟胚取材方便，不受季节限制，数量也能保证，是开展大麦遗传转化最为方便实用的受体。但是，由于受各种因素的影响，大麦成熟胚组织培养植株再生率目前还非常低。1984年，Lupotto(Annals of Botany，54：523-529)首次报道使用大麦种子完整的成熟胚诱导愈伤组织，并获得了再生植株，但再生率很低，只获得了2株再生苗。郭晓琳等(2005，植物遗传资源学报，6(4)：418-422)将大麦种子沿腹沟纵切，切面朝下接种到培养基上，愈伤诱导率达到70％，绿苗分化率(分化的绿苗数/接种的愈伤数)在20％左右。He和Jia(2008，Plant Cell Tiss Organ Cult，95：251-254)使用胚乳支持的方法诱导裸大麦的成熟胚，在一定程度上提高了愈伤诱导率和分化率。Han等(2011，J Zhejiang Univ-Sci B，12(5)：399-407)使用二等分纵切的方法，将切下的成熟胚接种到培养基上，愈伤诱导率达80％左右，绿苗分化率15％左右。然而这些方法都存在离体胚发芽的现象，严重抑制了初代愈伤组织的形成，是造成成熟胚组织培养效率低的主要原因之一。另外大麦颖果被颖壳紧密包被(裸大麦除外)，腹沟部分难以完整去壳，表面消毒效果差，所以上述方法中大多存在诱导过程极易污染的现象，显著降低了组培效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种有效抑制发芽/生根的大麦成熟胚组织培养方法及所用培养基，采用该方法能解决目前大麦离体成熟胚培养极易出芽/长根、抑制愈伤组织生长的现象和组织培养污染率高，绿苗分化率低等问题，使用该方法能获得较高的绿苗分化率。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种大麦成熟胚离体培养基，包括诱导愈伤培养基、分化培养基和生根壮苗培养基；

诱导愈伤培养基的制备方法如下：

每升诱导基液先调节pH为5.7～5.9，然后加入3.8～4.2g的植物凝胶(Phytagel)；接着进行高温、高压的灭菌处理(为常规的灭菌处理方式，下同)，最后加入过滤灭菌(例如采用0.2μm微孔膜过滤灭菌，下同)，处理后的维生素B₁(VB₁)9～11mg、维生素B₆(VB₆)0.9～1.1mg和烟酸0.9～1.1mg；

诱导基液由以下含量的组分组成：