[发明专利]一种腈水解酶及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种新的腈水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备重组酶的方法，以及该重组腈水解酶在水解邻氯扁桃腈或其结构类似物，制备(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物方面的应用。

背景技术

(R)-邻氯扁桃酸是抗凝血类药物氯吡格雷的重要手性中间体。而其类似物是一类重要的手性合成砌块，被广泛应用于多种药物的合成。如头孢类半合成抗生素、抗肿瘤及抗衰老药物的重要中间体；也可以作为手性拆分试剂，用于拆分其他的手性药物或医药中间体。

目前研究人员已经开发出多种制备(R)-邻氯扁桃酸的方法，主要有化学法和生物法。传统的化学拆分法，主要是利用手性胺类化合物，如α-甲基苄胺、(-)-麻黄碱和辛可宁等，通过与外消旋的邻氯扁桃酸形成非对映异构体盐的方法，得到单一对映体的邻氯扁桃酸。

生物法制备(R)-邻氯扁桃酸已经成为研究的热点。例如，酯酶途径主要有两种：第一种，是在邻氯扁桃酸的羟基上酰化，然后由酯酶催化拆分，从而得到光学纯的产物和剩余底物(Appl Microbiol Biotechnol，2010，86：83-91)。第二种，则是在邻氯扁桃酸的羧基上甲酯化，然后酶促拆分(Biotechnol Bioeng，2008，101：460-469)。

除了酯酶催化拆分之外，还有文献报道了氧化还原酶不对称还原邻氯苯甲酰甲酸，生成(R)-邻氯扁桃酸(J Chem Technol Biot，2009，84：1787-1792)。

腈水解酶能够催化有机腈化合物一步水解为羧酸并产生等摩尔量的氨，该过程反应条件温和，不需要任何辅因子的参与，反应效率高，反应过程具有较好的区域和立体选择性。由于邻氯扁桃腈易于大规模生产且成本低廉；更为重要的是，当(R)-邻氯扁桃腈被对映选择性地酶促水解为(R)-邻氯扁桃酸后，剩余的(S)-邻氯扁桃腈在弱碱性条件下可以自发地消旋转化为外消旋的邻氯扁桃腈，这样理论上可以得到100％的产率。因此，获得对邻氯扁桃腈具有高水解活性和对映选择性的腈水解酶，有利于实现(R)-邻氯扁桃酸的大规模工业化生产。而目前，已知的腈水解酶对于邻氯扁桃腈的底物耐受性普遍较差，多数在50mmol/L以下(J Am Chem Soc，2002，124：9024-9025；J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37：741-750；Enzyme Microb Technol，2010，47：140-146)。虽然已有文献报道腈水解酶能够在水-甲苯两相体系中水解200mM邻氯扁桃腈，但其产率和ee较低，产物浓度157mmol/L，ee＝90.4％(J Biotechnol，2011，152：24-29)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种新的水解邻氯扁桃腈获得手性(R)-邻氯扁桃酸的腈水解酶，该腈水解酶在所述催化反应中底物耐受性好，产率和ee值较高，具有催化活性高、对映选择性强、对环境友好的优点。本发明还提供该腈水解酶基因以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，重组酶的制备方法，以及该重组腈水解酶的应用。

本发明通过下述技术方案解决上述技术问题：

本发明的技术方案之一是：一种腈水解酶，该腈水解酶是如下(a)或(b)的蛋白质；

(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

(b)在蛋白质(a)的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

蛋白质(b)是在蛋白质(a)的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。其中，所述的“几个”是指二个至小于100个，更佳的小于30个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，只要该融合蛋白还是具有腈水解酶活性，本发明发现这样的融合蛋白同样可以水解邻氯扁桃腈获得手性(R)-邻氯扁桃酸的腈水解酶，并达到底物耐受性好，产率和ee值较高的效果。也就是说本发明发现只要由(a)衍生的蛋白质具有腈水解酶活性，且衍生方式如上所述，则都可以达到本发明的发明目的。本发明所述的腈水解酶来源于Labrenzia aggregate，更佳的来源于Labrenzia aggregate DSM 13394。所述的腈水解酶可以从Labrenzia aggregate中分离获得，也可以从重组表达该腈水解酶的表达子中分离获得，也可以人工合成获得。