[发明专利]一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法无效
申请号: | 201210043685.9 | 申请日: | 2012-02-24 |
公开(公告)号: | CN102559616A | 公开(公告)日: | 2012-07-11 |
发明(设计)人: | 李智涛;白永杰;高秀菊;董璠;冯艳铭 | 申请(专利权)人: | 河南科技大学 |
主分类号: | C12N7/04 | 分类号: | C12N7/04;C12N15/40;C12N15/63 |
代理公司: | 洛阳公信知识产权事务所(普通合伙) 41120 | 代理人: | 张彬 |
地址: | 471000 河*** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 含诺如 病毒 rna 片段 颗粒 及其 制备 方法 | ||
技术领域
本发明涉及诺如病毒,具体说是一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。
背景技术
诺如病毒(Norovirus,NoV)是由美国学者Kapikin,首先于1972年采用免疫电镜方法,从发生于1968年在美国俄亥俄州诺沃克地区的一所学校暴发的胃肠炎病人的粪便标本中检出,并以发现地名称命名为诺瓦克样病毒(Norwalk—like virus,NLvS)。1995年,国际病毒分类委员会第六次分类报告中正式将诺如病毒列入杯状病毒科、诺如毒属。诺如病毒引起的腹泻,具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点。全年均可发生感染,常引起集体暴发,感染对象主要是学龄儿童和成人,本病的暴发大部分具有季节性,呈现秋冬季高发。诺如病毒是全球范围内引起人类急性胃肠炎的最重要的病原之一,可导致严重的食品安全和公共卫生问题。诺如病毒感染与世界上超过90%的病毒性腹泻相关。
诺如病毒感染的流行特点:1、低感染剂量(<10个病毒粒子);2、较长的排毒时间(viral shedding),甚至病人在症状消失后仍可排出病毒,这增加了二次传播的风险;3、在较高的氯溶液和较宽的温度(冷冻-60℃)条件下依然保持稳定;4重复感染,可能是由于诺如病毒毒株之间缺乏交叉保护作用和缺乏长效免疫。
根据外壳蛋白序列的不同,诺如病毒可以分为5个基因组(genogroups),其中能感染人的病毒株属于GI、GII和GIV,总体来说,GII是优势毒株。其中,GII-4为优势基因型。20世纪80年代以前,诺如病毒的诊断方法主要有直接电镜法以及免疫电镜法、放射免疫法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)等。由于这些方法敏感性和特异性较低且材料来源有限,很难广泛应用。自20世纪90年代以后,随着诺如病毒的全基因序列测序的完成,相继建立了多种灵敏、特异的诊断方法。(1)ELISA法。利用基因工程方法对诺如病毒株的重组衣壳蛋白进行表达,为诺如病毒的检测和血清流行病学研究提供了简便可行的方法。但由于不同株间衣壳蛋白抗原具有相当大的变异性,这降低了该法的特异性和敏感性,且材料来源有限,限制了该法的使用。(2)RT-PCR法。该方法是目前用于诺如病毒的最敏感、也是最广泛的检测方法。因为在检测后能够测序,所以在为确定感染源的分子流行病学研究和区别相似的暴发之间的连续时特别有用。最近,荧光定量RT—PCR由于具有灵敏和快速优势,被应用于胃肠炎暴发时大量粪便样品的检测。但由于病毒的变异和重组,针对特定毒株的引物和探针不能检测所有的毒株,常常导致漏检,所以能够检测所有毒株的引物和探针的设计就显得非常关键。由于诺如病毒潜在的传染性及其RNA的不稳定性,所以研制无传染性及稳定的质控标准品,对于诺如病毒RT-PCR 试剂盒的研发具有重要意义。
MS2噬菌体属于正性单链RNA球形病毒,基因组由3569个核苷酸构成,编码装配蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等四种蛋白质分子。 噬菌体由180个包膜蛋白单体、1个成熟酶蛋白分子和一个基因组RNA组成。研究发现MS2噬菌体包膜蛋白与操纵子RNA 序列有特异性相互作用,这种作用可引发噬菌体外壳的组装,同时,将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。如果将某一病毒RNA的cDNA连接于MS2噬菌体包膜蛋白基因cDNA下游,转录后将得到带有噬菌体操纵子RNA序列的特定病毒RNA转录本,操纵子RNA序列就可以引发噬菌体包膜蛋白组装成外壳,并将携带有某一病毒RNA序列的噬菌体基因组包装到包膜内,形成噬菌体病毒样颗粒。在实际构建质粒表达载体时,需将噬菌体装配蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆连接于表达载体启动子下游,这样,经过诱导表达后,所表达的包膜蛋白不仅作为病毒样颗粒的结构成分,而且可作为基因表达调节因子和pac信号对表达过程进行调节,使包膜蛋白的表达和RNA的转录协调一致,此时,组装所得噬菌体样颗粒具有成熟特性,从而具有核糖核酸酶抗性。
发明内容
本发明针对上述问题提供一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法,该病毒颗粒具有耐核糖核酸酶的特点,作为诺如病毒RT-PCR检测的标准品和质控品具有很好的稳定性,易于保存和运输,对诺如病毒的基因诊断试剂盒的开发具有较强的实用价值。
本发明一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒,由MS2噬菌体外壳蛋白包裹诺如病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体;其内含有诺如病毒ORF1和ORF2之间保守基因区RNA序列,可表达诺如病毒GⅡ-4型保守区基因,具有耐核糖核酸酶的特性。
一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法,其具体制备步骤为:
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