[发明专利]一种棘阿米巴荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，具体说是一种棘阿米巴荧光定量PCR检测试剂盒。       

背景技术

棘阿米巴是一种自生生活原虫，广泛存在于水和土壤中，它已在池塘、淡水、海水、土壤、灰尘、腐败植物、空气、空调、医疗设备(如胃清洗管和牙灌洗器)、接触镜、接触镜溶液，及人畜粪便中甚至人和动物组织中分离出。根据大小和形态不同，将棘阿米巴分为I、II和III三组，目前，已确定的种属有27种。通过己糖激酶、酯酶、酸化磷酸酶可快速区分种属，其中至少有8种和人类棘阿米巴角膜炎相关，包括哈氏阿米巴属(Hartmannella)、卡氏棘阿米巴(A·castellanii)、柯氏棘阿米巴(A·culbertsoni)、多噬棘阿米巴(A·polyphaga)等，其中以卡氏棘阿米巴和多噬棘阿米巴引起的棘阿米巴角膜炎最常见。目前棘阿米巴有15种基因型(T1～T15)，已知有致病性的包括T3、T4、T5、T6、T11、T15型，其中绝大多数棘阿米巴角膜炎患者的基因型为T4。国内研究证实，棘阿米巴性角膜炎的棘阿米巴基因型多为T4型，少数为T3型，某些特殊的18S rDNA基因型的棘阿米巴有较强的嗜角膜性，但其确切的分子机制及由此导致的生物学特性和致病性的不同，尚有待深入研究。

人类棘阿米巴感染是条件性的，可累及免疫抑制病人的皮肤和中枢神经系统，引起皮肤棘阿米巴病和肉芽肿性脑膜炎，还可侵犯角膜引起角膜炎。

目前，诊断棘阿米巴的主要手段有以下3种：

1．显微镜检查：角膜刮片是一种有效方法，通常采用10％的KOH湿涂片直接镜检可见棘阿米巴，苏木精-伊红染色和吉姆萨染色亦能查见滋养体和包囊，星形包囊更易查见，而含有空泡和核仁居中的滋养体与炎症细胞相似。其检测较困难，阳性率较低，容易漏检。激光共聚焦显微镜作为一种非创伤性的诊断手段以及其高特异性和敏感性在一些地区成为棘阿米巴感染眼睛的优先诊断技术。

2．培养法：稀释的胨酵母膏葡萄糖培养基(如0.05，0.05，0.1％w／v)用铺有一层大肠杆菌或产气肠杆菌的1.5％非营养琼脂进行固化，棘阿米巴生长丰富。根据阿米巴数目的不同，可在28℃~30℃培养数天到数周。本法耗时长，难以适应临床需要。

3．分子生物学检查：用PCR技术诊断棘阿米巴感染显示了高敏感性与特异性。多以l8S rDNA为模板，利用特异性引物JDP1-JDP2配合来检测棘阿米巴原虫，证实18S rDNA的PCR扩增技术对诊断早期棘阿米巴感染有重要的临床应用价值。但是，该方法的灵敏度和特异性尚有待于进一步提高，特别是扩增后的电泳检测容易引起PCR产物污染，造成假阳性结果。

发明内容

本发明的目的是根据棘阿米巴18S基因保守区设计的引物和TaqMan探针，提供的一种检测棘阿米巴的实时荧光定量检测试剂盒，实现对棘阿米巴寄生虫感染的快速、特异性检测。

一、一种检测棘阿米巴的实时荧光定量检测试剂盒

一种检测棘阿米巴的实时荧光定量检测试剂盒，试剂盒内设有DNA提取液、特异性引物、TaqMan探针、PCR缓冲液、dNTP、尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）、DNA聚合酶和DNA定量标准品。

所述的DNA提取液由分装的异丙醇、体积浓度为75%的乙醇、和TE缓冲液和样品处理液（体积比为25: 24：1的TE饱和酚、氯仿和异戊醇混合溶液）组成；

所述的特异性引物序列如下：

上游引物：5'-GCC CAG ATC GTT TAC CGT GAA-3'

下游引物：5'-TAA ATA TTA ATG CCC CCA ACT ATC CC-3'

所述的TaqMan探针序列为：5'-FAM-CT GCC ACC GAA TAC ATT AGC ATG GG-BHQ1-3'

其中FAM为荧光报告基团，HBQ1为荧光淬灭基团。

所述的PCR缓冲液，包含的成份如下：10-100mmol/L 的Tris-HCl（pH 8.0）、质量浓度为0.1%-0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚、质量浓度为0.1%的乙基苯基聚乙二醇和1.0-10.0mmol/L 的氯化镁。

所述的dNTP为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的等摩尔数混合物；

所述的DNA定量标准品，是人工构建的重组质粒DNA，由目的基因（其碱基序列如序列表序列4）和pUCm?T质粒载体连接所构建的，其浓度为10⁶拷贝/微升； 

所述的尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和DNA聚合酶，均为市售商品。