[发明专利]一种蕨类植物配子体石蜡切片的方法

权利要求书

1.一种蕨类植物配子体石蜡切片的方法，包括取材与固定、冲洗、染色与蓝化、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片、贴片、脱蜡与封片、镜检及照相，其特征在于固定采用改良的FAA固定液体，其组成为福尔马林∶冰醋酸∶30％乙醇＝1∶1∶18。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述脱水和透明过程中，纯酒精和纯二甲苯处理阶段时间为5min，其它各阶段时间均为10分钟。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于染色采用苏木精整体染色法。

4.权利要求1或2所述的片法，其特征在于具体步骤如下：

1)取材与固定

第一次培养材料时，根据发育时间确定精子器、颈卵器、胚胎发育和孢子囊发育各个时期的时间范围，然后经过多次重复培养，大量取材；在显微镜下观察并取材，尽快将材料快速置于改良的FAA固定液中，并在4℃冰箱中保存，在改良FAA固定液中固定24h；

2)冲洗

将固定好的材料，在小流量流水冲洗1～2h，冲后30％酒精，50％酒精，70％酒精各30min；

3)染色与蓝化

爱氏苏木精染色2～5d，细胞核成红紫色，再利用自来水冲洗，使细胞核成深蓝色，细胞质染成浅蓝色，蓝化时间为3～5h即可；蓝化合适的材料放入30％的酒精中进行梯度脱水；

4)脱水与透明

采用乙醇逐级脱水法，即30％乙醇→50％乙醇→70％乙醇→85％乙醇→95％乙醇→无水乙醇I→无水乙醇II，每级10min，其中无水乙醇5min；脱水后经过二甲苯以过渡，当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态；2/3乙醇+1/3二甲苯→1/2乙醇+1/2二甲苯→1/3无水乙醇+2/3二甲苯→纯二甲苯I→纯二甲苯II，每级10min，其中纯二甲苯5min；

5)浸蜡与包埋

用石蜡逐渐取代二甲苯，具体过程是：常温下将削好的蜡屑，逐渐投入盛有材料的二甲苯小瓶中至饱和→37℃温箱中加蜡屑，置于恒温箱过夜→将小瓶中原液倒去1/2后补入1/2已熔化的纯蜡，此过程重复2～3次→全部换纯蜡2次，每步骤0.5～1h；

先叠成小的纸盒，再将熔化的石蜡倒入其中，迅速将材料移至盛石蜡的纸盒中，用镊子或解剖针将材料摆正位置后，盒中石蜡逐渐凝固。为加速凝固，当石蜡表面凝结成乳白色时，将盒移入冷台上即可迅速变成硬块；

6)切片

将已修好并固定的石蜡块台木装在切片机的夹物台上，切片刀固定在刀夹上，扭动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，并调整它们之间的角度，调整厚度计，控制切片厚度为8μm，切片时，右手摇动旋转轮手柄，左手持毛笔将蜡带提起，移至一张纸板上，准备粘片；

7)贴片

在一清洁的载玻片上涂一薄层粘贴剂(由蛋清、甘油调制)，再滴加1～2滴蒸馏水，用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，摆好位置，注意蜡片光亮平整的一面贴于载玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签，然后将载片在酒精灯上微热或置于预先加热的展片台(温度保持在40～45℃)上，使蜡片展开，然后把载玻片放在展片夹上编好记号置于37℃温箱烘干12h；

8)脱蜡与封片

将干燥好的切片泡在二甲苯中1～2h进行脱蜡处理，之后取出；等切片表面的二甲苯挥发后，滴一滴加拿大树胶，取干净的盖玻片从树胶滴一侧放下盖好，避免产生气泡；贴上标签，放在烘箱中充分脱苯，之后收入切片盒中；

9)镜检及照相

光学显微镜下观察并记录，显微摄影装置下显微拍照。