[发明专利]纤维素酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物发酵方法，特别涉及纤维素酶的发酵方法。

背景技术

纤维素酶是专用于分解纤维素的酶，其为一类可以将纤维素分解成多糖或单糖的蛋白质或RNA。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。它不是单一酶，而是一种多组分的复合酶系，现已确定纤维素酶含有三种主要组分：(1)内切型-p-葡聚糖酶：它能以随机的形式在纤维素聚合物内部的非结晶区进行切割，对末端键的敏感性比间键小；主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖。(2)外切型-p-葡聚糖酶：它能从纤维素链的非还原性末端切割，生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。(3)纤维二糖酶：它能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。这种酶的专一性比较差。纤维素酶的体系较为复杂，其每一个组分通常又由若干亚组分组成，近年来发现纤维素酶复合体系中还存在着破坏纤维素晶体结构的“氢键酶”，在将天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠多种组分的协同作用才能完成。

纤维素酶在食品行业和环境行业均有广泛应用。在进行酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶(amylase)、蛋白酶(Protease)等。纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。但是，产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纤维素酶的制备方法，该方法操作简单，适用于工业化生产。

上述技术目的是通过如下技术方案实现的：

纤维素酶的制备方法，具体包括以下步骤：在温度为20-35℃、pH为4.0-5.0的条件下，用里氏木霉作为宿主细胞分泌纤维素酶，其中，以烟草废弃物作为碳源，豆饼粉为氮源，培养时间为6-10小时，通气量0.2-0.6vvm，搅拌速度为200-500转/分钟。

其中，所述烟草废弃物以纤维素的含量计其浓度为20-30g/L，所述豆饼粉的质量相当于烟草废弃物的0.2-0.6。

优选为，所述温度为32℃。

所述进一步优选为pH为4.5。

其中，所述烟草废弃物以纤维素的含量计其浓度为25g/L，所述豆饼粉的质量相当于烟草废弃物的0.4。

所述通气量优选为0.4vvm。

本发明的有益效果在于：

1)本发明均采用废弃物作为培养基原料，绿色环保，其中，以烟草废弃物中富含的纤维素为碳源，以压制完菜油的都粉饼为氮源，显著降低了生产成本。

2)本发明制备的纤维素酶，其酶活力高，工艺简单。

具体实施方式

1菌种及保藏

纤维素酶生产采用里氏木霉的优良变异株，为实验室保藏菌种，最初来自美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultULreCollection)ATCC56764菌株。将菌种由真空冷冻干燥管中取出，移至斜面培养基上，在30℃下恒温培养7天，待孢子成熟后，置于4℃冰箱中保存备用。

2原材料

以烟草废弃物为碳源：取100g粒径为20目的烟草废渣，加入相当于烟草的质量10倍的水，在100℃条件下进行溶解反应30分钟，得反应液，将所述反应液进行固液分离，取液体，所述液体为纤维素溶液；在所得纤维素溶液中加入体积相当于纤维素溶液1倍的去离子水，搅拌30分钟后进行过滤，所得滤渣为碳源。

氮源：豆饼粉，即黄豆榨油工艺中的剩余物。

3发酵过程

250mL三角瓶中装液50mL，取2mL里氏木霉抱子悬浮液(其含有105个分生孢子/mL)移入种子培养基中，在30℃、pH4.8、180r/min条件下振荡培养2d，使菌丝量(干重)达8g/L，制成液体菌种。种子培养的配制具体为：葡萄糖10g，蛋白陈1g，Mandels营养盐浓缩液100mL，Mandels微量元素浓缩液1mL，IM柠檬酸缓冲液50mL，H₂O1000mL，混匀后于121℃灭菌20min。