[发明专利]鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种禽类及其制品安全检验领域的PCR检测方法及其中的核酸和引物对，具体是一种鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法。

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是沙门氏菌致病常见的血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，但有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热，对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，形成了哥本哈根变种、宾斯变种及O型变种三个变种。该菌的检测主要依靠传统的培养方法(参见国标GB/T4789.4-2008)，该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试鉴定，虽然结果可靠，但操作复杂，通常要3～5天才能得出检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情的蔓延。之后，许多研究学者建立了如荧光抗体技术、免疫磁珠富集法、ELLSA、自动酶联免疫荧光法、免疫组化、显色培养基法、DNA探针技术等检测方法，但在实践中都有不同程度的局限性。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，逐步应用于沙门氏菌的检疫之后，对沙门氏菌病诊断和防治工作起到了积极作用。有学者先后以鼠伤寒沙门氏菌fimA、fimY、fliC、fljB等基因为目的基因，对鼠伤寒沙门氏菌进行特异性PCR检测，但是由于靶位点特异性不强，PCR结果产生假阳性，因而产生判断困难。另外，有学者根据鼠伤寒沙门氏菌16S DNA、spvC、invB、fimA基因设计4对引物，通过多重PCR方法检测鼠伤寒沙门氏菌，但与普通PCR相比，多重PCR的成本、实验技术等要求都相对较高。

经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法、核酸及引物有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法。采用本发明的检测方法检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判定简单。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明设计一种鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一，根据鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA序列中保守且特异的STM4493基因序列SEQ ID NO：1设计扩增引物对；所述引物对具体为：正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物序列如SEQ ID NO：3所示。

步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增；PCR检测体系具体为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，5μM引物对1μL，Taq酶1U，模板溶液0.5～2μL，最后用双蒸水补至25μL；PCR检测体系扩增参数具体为：95℃预变性5min后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s；共35个循环；最后72℃延伸10min，降温至16℃，结束。

步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察，若在456bp位置存在单一扩增条带，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若没有，则样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，检测成本低；避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、检出率底、假阳性较多等缺点。同时，本发明可用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更具实用性；本发明检测的靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。

附图说明

图1为实施例2中鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法特异性评价实验凝胶电泳结果图；

图2为实施例3中鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法灵敏性评价实验凝胶电泳结果图；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Habor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。