[发明专利]一种检测食品中呋喃它酮代谢物含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种直接检测食品中呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。

背景技术

呋喃它酮(FTD)属于硝基呋喃类药物，是一种广谱抗生素，曾被广泛应用于家畜、家禽中痢疾、肠炎、球虫病的预防和治疗。但研究表明，该药物具有严重的致癌等毒副作用，因此近十多年来世界各国陆续禁用该药物并限定了残留标准。然而国内外仍不时有呋喃它酮检测超标的报道。呋喃它酮抗生素对光敏感，具有代谢快速的特点，在动物体内的半衰期不过数小时，通常不太可能检出原药残留，而其代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)在体内较稳定，因此可通过检测AMOZ的含量判断是否存在违规使用呋喃它酮。

1990年欧盟颁布条例，规定硝基呋喃类药物及其代谢产物在动物源性食品中的残留检测限为1.0μg/kg，而AMOZ的检测限为300ng/kg。澳大利亚(1993)，菲律宾(2001)，巴西(2002)，泰国(2002)和美国(2002)也相继颁布条例禁止其使用。我国农业部文件农牧发[2002]1号文件也规定动物源性食品中硝基呋喃类药物及其代谢物为不得检出。

AMOZ的检测方法主要是色谱分析法。由于原药化合物半衰期通常只有几小时，而其代谢产物则可与动物组织中的蛋白结合而形成稳定的化合物，稳定期可长达几个星期，因此，目前国内外报道多见于检测其代谢物。由于硝基呋喃代谢产物分子量比较小，为了增加分子量和产生强紫外吸收，使结果更加精确，现有的分析方法多为先让硝基呋喃代谢产物在酸性条件下水解，同时用2-硝基苯甲醛等衍生化试剂进行衍生化，所生成的代谢物的衍生物经提取和进一步净化，再用高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等仪器进行检测。我国质检总局发布的国家标准(GB/T21311-2007)，将样品在酸性条件下水解，同时用2-硝基苯甲醛进行衍生化，调pH＝7.4后，用乙酸乙酯提取生成的衍生物(NPAMOZ)，正己烷净化，再用液相色谱-串联质谱进行定性检测，采用稳定同位素内标法进行定量测定。尽管色谱分析方法较准确，但色谱法仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高，而且不能直接测定食品中AMOZ含量。

酶联免疫吸附分析方法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，已广泛用于临床、药物、食品和环境等分析领域。国内已有申请以多克隆抗体为基础的ELISA测定食品中AMOZ含量的专利，申请号为200810219298.X。但是其仍然不能直接测定AMOZ，而需要用2-硝基苯甲醛进行衍生化后，再测定AMOZ与2-硝基苯甲醛形成的衍生物NPAMOZ。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种直接检测食品中AMOZ含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是基于抗原与抗体之间特异性反应而建立的分析方法。

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。直接检测食品中AMOZ含量的酶联免疫吸附分析方法：

一种检测食品中呋喃它酮代谢物含量的方法，包括以下步骤：

步骤一：AMOZ修饰物的制备；

步骤二：免疫原和包被抗原的制备；

步骤三：AMOZ单克隆抗体的制备；

步骤四：建立测定AMOZ的酶联免疫吸附分析方法；

步骤五：ELISA对加标样品中AMOZ含量的测定。

其中，所述步骤一包括：

1)CPAMOZ I的合成

称取3-羧基苯甲醛加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，产物简写为CPAMOZ I，其反应式如下：

2)CPAMOZ II的合成

称取4-羧基苯甲醛加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入AMOZ，溶解完全后，65℃氮气保护下反应5～12小时，取出，将反应液离心，弃去上层清夜，沉淀用冰无水乙醇洗涤后，得白色沉淀，真空抽干，4℃下保存，产物简写为CPAMOZ II，其反应式如下：

3)CPAMOZ III的合成