[发明专利]一种测定蛋白中糖基的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物蛋白检测领域，具体涉及一种测定蛋白中糖基的方法。 

背景技术

糖基化(glycosylation)指是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，是蛋白质的一种重要的翻译后修饰，约有一半以上的蛋白质发生了糖基化，糖蛋白的糖基可影响生物活性，有介导受体识别的作用，可增加可溶性，调节并稳定蛋白构象。因此特殊的糖基结构与许多蛋白药物的安全有效性相关，它对蛋白质分子的生物活性、稳定性、免疫原性以及分子转运、识别等都有十分重要的意义，同时蛋白糖基化程度和糖链结构变化经常是肿瘤及其它疾病的发生标志。因此，在生物药物研究开发过程中，譬如工艺开发、制造纯化、剂型开发和稳定性检测过程中，蛋白质中糖基的测定是十分重要的。 

蛋白质发生的糖基化反应分为两种类型，一类是在细胞质的内质网中发生的，由酶催化进行的缩合反应，见于蛋白质翻译后的糖基化修饰。另一类为非酶催化的糖基化反应，是由葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、果糖等醛糖的醛基与蛋白质分子中氨基酸(通常为赖氨酸)的NH₂基缩合形成Shiffs碱，并进一步经分子重排形成更稳定的糖化产物。 

蛋白质糖基化的类型包括N-和O-两种糖基化类型，N-糖基化和O-糖基化中修饰蛋白的糖链与蛋白具有不同的连接方式，N-糖基化中糖链通过N原子与天冬酰胺相连接，糖链中包含一个由3个甘露糖和2个GlcNAc组成的5糖核心，靠近蛋白连接端的为2个GlcNAc。 

近年来，测定蛋白中糖基的方法一般是首先将糖链从蛋白上完整的脱下来，然后用荧光试剂与之反应使其能够被检测到，最后用合适的洗脱体系和色谱柱将其分离并检测。目前已知具有糖基化分析仪器或试剂的公司有：Waters，QA-bio，NEB，prozyme，Sigma，Agilent。其中Waters公司可提供除酶以外的其他试剂和仪器，该公司有一套较为成熟的糖基化分析方法，尤其在糖链纯化和色谱分析方面比较领先，他的纯化系统和色谱分离系统，在切糖方面不对蛋白变性，而是通过提供一个类似表面活性剂的试剂来改善切糖酶在切糖时的空间位阻，这种方法在蛋白分子量较小，糖基化情况比较简单的时候比较有效，但在应用到复杂糖基化蛋白，仍存在脱糖不完全的情况，而且用该方法切糖效率不高；另外Waters公司提供的方法中样品还原时间长、温度较高，这可能导致糖链中唾液酸脱落，无法全面有效的计算唾液酸的含量等问题。QA-bio公司可以提供全套的试剂以及酶等，也提供一个标准方法供选择，但 问题是蛋白在切糖前用100℃水浴变性，这样的条件太剧烈，不利于糖链结构的保护。另外，糖链末端的唾液酸对pH值也比较敏感，较低的pH值同样会导致唾液酸脱落，而QA-bio公司提供的糖链纯化标准方法中需要用到三氟乙酸，也有可能破坏糖链结构。 

目前蛋白中糖基的分析过程存在如下难点：如何保证糖链被完全从蛋白上切下来并不被破坏？如何提高检测结果重现性？寻求一种脱糖完全且糖链结构保持完整，结果重现性好的蛋白中糖基的测定方法变得十分重要。 

发明内容

为了解决现有技术中检测蛋白中糖链方法存在的切糖不完全、难以保全完整的糖链结构、以及重现性差等一系列技术问题，本发明提供了如下技术方案： 

本发明一方面提供了一种测定蛋白中糖链的方法，其前处理过程为先将蛋白进行换液处理后，再还原酶切后，直接加入切糖酶切除糖链，并对获得的糖链纯化。 

上述酶切过程中所用的酶为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶或天冬酰胺蛋白酶的一种或多种；所述切糖酶为肽N-糖苷酶F、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、α1-2，3甘露糖苷酶或α1-2岩藻糖苷酶的一种或多种；其中所述丝氨酸蛋白酶优选为胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白内切酶GluC，所述金属蛋白酶优选为羧肽酶、中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原酶等，胰蛋白酶和糜蛋白酶也属于金属蛋白酶，所述巯基蛋白酶优选为组织蛋白酶B、H、L，所述天冬酰胺蛋白酶优选为组织蛋白酶D。 

上述换液过程是将溶液体系替换为符合酶切的溶液体系。譬如，酶切蛋白为胰蛋白酶，将溶液换为适合胰蛋白酶酶切的碳酸氢铵缓冲液(pH＝8.3)体系，或者利用Merck的酶切缓冲液体系是可在酶切前将溶液换为超纯水等等。