[发明专利]筛选肿瘤早期诊断靶标的Small RNA-Seq库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种由血液样本构建核酸靶标数据库的方法，尤其是针对单一个体的小量血样构建二代测序用Small RNA-Seq库的方法。 

背景技术

microRNA(miRNA)是细胞内由18-25个核苷酸组成的非编码小RNA。miRNA通过与靶基因mRNA的3’UTR(untranslated region)不完全互补结合，抑制靶基因的翻译。日益增多的研究显示多种miRNA可作为致癌基因和抑癌基因参与细胞的增殖，并可调控肿瘤干细胞的分化及肿瘤的迁移过程。miRNA在多种癌症的起始和发生发展过程中发挥着重要作用。对miRNA在癌症发生发展的作用机制的研究已成为近年生物医学领域的前沿热点课题。 

目前绝大多数与癌症相关的microRNA(miRNA)的研究是利用肿瘤组织和相邻组织，通过比较两者miRNA的表达水平，寻找与癌症相关的miRNA，并进一步揭示miRNA的功能。但是这种研究方法取材不方便，对病人的创伤较大，不适于早期诊断。此外，由于取材范围小，代表性和重复性有限。因此，需要开发新的诊断方法。已有研究显示血液中的某些miRNA可作为多种癌症(肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、淋巴癌、乳腺癌等)诊断的潜在生物学标记。目前关于血液中miRNA的研究方法可分为三类： 

1.在血液(血清或血浆)中通过qRT-PCR技术检测已报道的肿瘤组织中异常表达的miRNA表达是否也异常。这种方法的局限是：a.在血液中不确定能检测到肿瘤组织中异常表达的miRNA。b.血液和肿瘤组织中的miRNA异常表达的趋势不一定一致。已有研究发现，肿瘤细胞从血液中获得对肿瘤生长有利的miRNA，从而使肿瘤组织内此miRNA的含量上调，血液中反而下调。 

2.利用miRNA芯片技术，在血液(血清或血浆)中检测已知miRNA的表达水平。这种方法的局限性是：a.仅能检测已知的miRNA的表达水平。b.此方法对表达量过低或过高基因的区分度较差。 

3.利用RNA-Seq技术，在血液(血清或血浆)中寻找可作为癌症早期诊断标记物的miRNA。这种方法的优点是：a.不仅可以检测已知miRNA的表达。还可分析未知miRNA的表达。b.RNA-Seq技术对基因表达量的分析比较准确，对表达量高或低的基因均有区分度。但是就目前建库的方法，需要的血液量较多，大约需要100ml血液，因此需要将相同癌症类型的多个个体的血液混台在一起建库、测序。因此这种方法的缺点是某个个体的异常表达可能导致平均值的上升或者下降，造成假阳性或假阴性，从而增加了后期验证的工作量。 

发明内容

基于上述现有技术的不足，也为了进一步提高在血液中寻找生物学标记物的准确性，本实验室通过对经典RNA-Seq建库技术多方面的改进，最终仅使用少量血液(4-10ml)即可完成建库工作的目的。这种技术突破让使用单一个体少量血液进行RNA-Seq成为可能，不仅可以更快速直接地寻找相同癌症患者发生共性变化的miRNA，还可以通过分析不同个体间表达的差异，避免由于某个具体的个体发生显著变化而引入的假阳性和假阴性，因此大大提高寻找到的生物学标记物的准确性，减少对生物学标记物后期验证的工作量。 

本发明提供一种针对单一个体的小量血样构建二代测序Small RNA-Seq库的方法，所获得的核酸数据库能够适用于靶标筛选和目标物(特别是小片段的RNA目标物)的诊断。 

本发明还涉及所述的建库方法用于制备针对特异性疾病的诊断试剂盒的应用。 

本发明还涉及使用所述的建库方法获得的针对特异性疾病的诊断试剂盒。 

本发明所述的特异性疾病可以是肝癌、结直肠癌肝转移、乳腺癌和结直肠癌等。 

本发明所述的针对单一个体的小量血样构建二代测序Small RNA-Seq库的方法包括如下步骤： 

1.血浆分离操作 

取新鲜血液样本，利用冷冻离心机，4℃分两步从血液内分离血浆，400g～600g离心8～15分钟，收集上清以去除血细胞；第二：1500g～2000g离心8～15分钟以充分去除细胞碎片，收集上清。 

由于血装内含有大量的RNase(RNA核酸酶)，因此，及时分离血浆后，-80℃低温保存，可降低RNase对RNA的降解。从而减少rRNA和mRNA的降解片段对small RNA分析的影响。 

2.总RNA提取