[发明专利]一种克隆细菌基因cDNA全长的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因技术领域。

背景技术

目前，基因功能研究已成为生命科学研究领域的重要课题，而获得基因的cDNA全长是研究基因功能的基础。获得基因cDNA全长后，可以明确基因启动子的位置以及基因的结构，从而为进一步研究基因功能奠定基础。

但长期以来，克隆基因cDNA全长一直是个难点。目前，获得基因cDNA全长的方法主要有：RACE(rapid amplification of cDNA ends)法，cDNA文库法，S1 nuclease mapping法，primer extension法等。但是，5’RACE操作步骤复杂，需要进行去掉Total RNA中5’裸露的磷酸基团、去掉mRNA的5’帽子结构、连接5’RACE Adaptor、反转录合成cDNA等步骤。其中，前3步均是在RNA水平的操作，步骤繁琐、耗时长，而mRNA极易降解，因此对操作的要求较高；同时5’RACE对总RNA质量和纯度的要求较高。且5’RACE试剂盒价格昂贵，实验成本很高。而细菌mRNA通常无polyA，这使得3’RACE难以成功。cDNA文库法需要繁琐的建库、筛库步骤。S1 nuclease mapping和primer extension需要放射性同位素和特殊的仪器，而一般实验室不具备此实验条件。上述方法步骤繁琐，费用昂贵，并且一次只能克隆一个基因的cDNA全长，无法同时对多个基因的cDNA全长进行克隆，比如RACE、S1 nuclease mapping、primer extension法一个反应只能获得5’UTR或3’UTR一个方向的序列。因此，需要开发一种经济、便捷、高效克隆基因cDNA全长的方法。

发明内容

本发明的目的是：提供一种克隆细菌基因cDNA全长的方法，该方法不仅能够一次同时获得基因的5’UTR和3’UTR序列，而且可以同时对多个基因的cDNA全长进行克隆，并且成本低廉。

本发明的另一个目的是：提供一种克隆细菌基因cDNA全长的方法在克隆细菌基因cDNA全长中的应用。

本发明的方法是：环化RT-PCR法。

其步骤是：

(1)总RNA的提取：利用细菌总RNA提取试剂盒或TRIzol试剂提取细菌总RNA。

(2)总RNA的自连环化：自连环化按如下方法进行：取总RNA 3-5μg(约5-8μL)，T4 RNA连接酶buffer 2μL，T4RNA连接酶5U，DNA酶抑制剂1μL，加dd H₂O(无RNase)至20μL。16℃连接20h后，将连接产物用10μL氯仿抽提一次(利用PCR管进行抽提)，然后用2.5倍体积无水乙醇沉淀RNA，用5μL ddH₂O重溶RNA备用。

(3)第一链cDNA的合成：将自连环化的总RNA，利用六核苷酸随机引物进行逆转录，合成第一链cDNA；所述逆转录按如下方法进行：分别将5μL环化RNA，1μL random primer(10pmol/μL)和5μL ddH₂O于65℃水浴5min后，放置于冰上；加入5×RT buffer 4μL，dNTP mixture(各10mM)2μL，RNase inhibitor(10U/μL)1μL，ReverTra Ace^R 1μL。将上述20μL反应体系42℃水浴放置90min使逆转录完成；85℃水浴5min使酶失活，4℃冷却后瞬时离心。

(4)双链cDNA的合成。针对目的基因设计反向引物(inverse primer，IP)，朝向5’UTR和3’UTR的引物分别命名为IP1和IP2。以合成的第一链cDNA为模板，以IP1和IP2为引物，进行PCR反应，同时获得基因5’UTR和3’UTR序列。

(5)双链cDNA片段的连接与测序。将步骤(4)中所述的PCR产物连接到T载体上，利用载体通用引物进行测序。

(6)基因cDNA全长的拼接。利用DNA序列分析软件将步骤(5)中所获得的序列与基因编码区序列进行拼接，便可获得基因的cDNA全长。

利用上述方法，我们可以快速获得细菌基因cDNA全长。

表1 用于扩增细菌17β-HSD基因和dcp基因5’UTR和3’UTR引物