[发明专利]动物病毒性疫苗脉冲释放系统、其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程领域，具体涉及一种动物疫苗脉冲释放系统、其制备方法及在动物疫病防治中的应用。

背景技术

疫苗免疫接种是预防、控制并消灭动物传染性疾病的最有效且最实用的方法。但是，传统的灭活疫苗以及代表未来发展方向的基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗等均存在不足，即免疫原性低，需要多次重复接种才能产生有效的免疫保护作用。解决这个问题的途径有两条，一是研制开发新型高效的免疫佐剂；二是研制开发可注射的疫苗抗原的控释系统，以恒定的、持续的、预定的方式将抗原递送至特定组织。

形态上类似病原体的颗粒性抗原比溶解性抗原更容易被抗原呈递细胞(APC)有效吞噬，从而引起更为强烈的细胞免疫和体液免疫。国内外正在研究用聚酯、明胶、聚丙烯淀粉、壳聚糖等作为佐剂，包裹疫苗，制成生物降解型聚合物微球，使抗原颗粒化，从而更有效地促进机体的细胞免疫和体液免疫。生物降解聚合物微球是近年疫苗佐剂的研究热点，也是研究最多也最成功的抗原载体系统。

微球的主要特征是它们能控制抗原的释放。微球可由两种或多种不同聚合物组成，所包载的抗原可以不同的速度释放。抗原长期释放相当于多次疫苗接种，从而产生高水平抗体，这将使研究开发接种一次的单剂疫苗成为可能。

现代动物生产采用集约化养殖的模式。动物疫病特别是病毒性疫病的防治是现代养殖业面临的关键问题之一。探索可单针注射的疫苗抗原的脉冲释放系统，可有效地降低免疫成本和劳动强度，减少动物应激，提高免疫效果。这在科学研究和生产实践中均具有重要价值。

发明内容

本发明公开了一种动物病毒性疫苗脉冲释放系统，通过采用聚合物制备含疫苗抗原的具有脉冲释放特性或缓释特性的疫苗微球，再将具不同释放特性的疫苗微球适当组合即构成疫苗脉冲释放系统。此种疫苗脉冲释放系统可用于动物病毒性疫病的单针免疫，取代普通疫苗的多针免疫，实现动物病毒性疫病的免疫防治。它比疫苗常规剂型使用更方便，可大大减轻劳动强度，减少动物应激，同时具有佐剂效应，使免疫效果更好。

本发明的动物病毒性疫苗脉冲释放系统的制备方法如下：

①采用复乳液中干燥法制备疫苗微球，其基本步骤包括：取初乳制成复乳，转移至烧杯中，磁力搅拌，室温下挥干溶剂，离心收集疫苗微球，用灭菌注射用水洗涤，无菌条件下真空冷冻干燥即得疫苗微球。

②采用喷雾低温萃取法制备疫苗微球，其基本步骤包括：将疫苗抗原与聚合物溶液混合制成混悬液，经喷头以雾状喷至冰冻的乙醇溶液中，再过滤除去乙醇，用灭菌注射用水洗涤，无菌条件下真空冷冻干燥即得疫苗微球。

③采用喷雾干燥法制备疫苗微球，其基本步骤包括：将疫苗抗原与聚合物溶液混合制成混悬液，经喷雾干燥器喷雾干燥即得疫苗微球。

④将疫苗微球按释放特性与抗原含量适当组合即成疫苗脉冲释放系统。

具体实施方式

实施例1

新城疫灭活疫苗抗原的制备

取新城疫弱毒La Sota株，按常规方法接种易感鸡胚，经培养，收获鸡胚液，经甲醛溶液灭活。取灭活后的新城疫病毒鸡胚液，在无菌条件下于4℃离心取上清液，上清液再经截留分子量为3万的超滤膜于4℃无菌条件下进行超滤浓缩。经超滤纯化浓缩后的上清液即为制备疫苗微球的抗原液。

实施例2

新城疫灭活疫苗微球的制备I

微球的制备：采用复乳液中干燥法制备新城疫灭活疫苗PLGA微球。将新城疫抗原液作为水相，将PLGA(50∶50)溶于二氯甲烷中制成适当浓度的溶液作为油相。将水相和油相按1∶10(V/V)比例混合，冰浴条件下超声乳化10秒得初乳。将初乳加入2％PVA溶液中，10000rpm转速下经乳化器高速搅拌30秒，得复乳。将所得复乳转移至烧杯中，在400rpm转速下磁力搅拌5小时，室温条件下挥干二氯甲烷，再在6000rpm转速下离心10分钟，收集微球，用灭菌水洗涤3次，真空冷冻干燥即得新城疫灭活疫苗PLGA微球I。

微球的质量评价：显微镜法观察微球形态并测定粒径；用紫外分光光度法或Bradford法测定微球中抗原含量，按公式计算包封率和载药量，体外法测定疫苗微球的释放曲线。

经测定，新城疫灭活疫苗微球I的体外释放呈两相模式，第一突释相在注射后半日内，第二突释相在注射后35日，两相之间为缓慢释放相。

实施例3

新城疫灭活疫苗微球的制备II