[发明专利]一种检测ATP适配子和ATP的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测ATP适配子和ATP的方法。

背景技术

三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)被广泛认为是细胞内的能量货币，在大多数酶反应中起着重要作用，ATP的浓度和消耗率与许多疾病的发生密切相关，例如：缺氧、低血糖、缺血和帕金森氏病等。传统测ATP的方法包括高压液相法、放射性同位素法等，其中高压液相法繁琐且昂贵，检测时间需要30分钟以上，且不能直接测定ATP的含量，灵敏度仅为毫摩尔级；放射性同位素方法的灵敏度高，但污染大，需要样品的防护和废弃物处理过程，不适合大量使用。近年来，核酸适配子作为核酸探针的一种，具有很强的亲和力和选择性，逐渐取代传统的抗体，被广泛应用于生化分析中。已有文献针对核酸适配子与ATP的特异性识别作用报道了几种检测ATP的方法，如金纳米比色法(先进材料，Adv.Mater.2007，19(22)，3943-3946)，荧光计法(德国应用化学，Angew.Chem.Int.Ed.，2004，43(36)，4777-4780；纳米快报，Nano Lett.，2006，6(3)，371-375)，电化学检测法(美国化学学会杂志，J.Am.Chem.Soc.，2007，129(5)，1042-1043)，但这些方法操作繁杂，样品消耗量大，难于微型化。

生物芯片是目前基因组学，蛋白质组学研究的重要工具，具有高通量，并对检测样品消耗量少等优点(基因生物学，Genome Biol.2001，2，research0004.1～0004.13)，由于适配子分子与靶分子的结合具有高灵敏度、高特异性的特点，因此将核酸适配子、ATP的特异性识别与生物芯片结合在一起的技术还未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有检测ATP的方法操作繁杂，样品消耗量大，难于微型化及灵敏度仅为毫摩尔级的缺点，而提供一种检测ATP适配子和ATP的方法。

一种检测ATP适配子和ATP的方法，包括以下步骤：

步骤一：将ATP适配子与点样液混合得到ATP适配子溶液，在基片上进行点样，得到ATP适配子生物芯片；

步骤二：将步骤一得到的ATP适配子生物芯片上的ATP适配子与CY5标记的DNA互补链进行杂交反应，得到荧光标记的ATP适配子生物芯片；

步骤三：将步骤二得到的荧光标记的ATP适配子生物芯片与ATP样品溶液反应，得到ATP与ATP适配子相互作用后的生物芯片；

步骤四：将步骤三得到的ATP与ATP适配子相互作用后的生物芯片放入微阵列扫描仪中进行检测，得到ATP适配子生物芯片的荧光检测信号。

所述的步骤一中ATP适配子的浓度为0.1μM～20μM。

所述的步骤一中的ATP适配子为3’-NH₂修饰的DNA适配子。

所述的步骤二中CY5标记的DNA互补链的浓度为0.08μM～0.1μM。

所述的步骤二中ATP适配子生物芯片上的ATP适配子与CY5标记的DNA互补链是在温度为25℃～30℃，相对湿度为80％～90％的恒温恒湿箱中进行杂交反应。

所述的步骤三中ATP样品溶液是由ATP反应溶液和ATP混合得到的，ATP反应溶液的组成为：含有21mmol/L氯化钾的15mmol/L～25mmol/L氨基丁三醇缓冲溶液；所述的ATP样品溶液的pH值为7.6。

所述的步骤三中反应温度为25℃～30℃，优选为25℃。

发明原理：本发明一种检测ATP适配子和ATP的方法，该方法采用DNA微阵列技术，固定ATP适配子，以带有荧光染料CY5的DNA互补链为标记物，通过杂交反应标记生物芯片，再利用ATP与ATP适配子的特异性识别作用，结合微阵列荧光扫描仪，获得生物芯片上荧光染料的荧光信号，可实现ATP适配子和ATP的同时检测。

有益效果：本发明提供的一种检测ATP适配子和ATP的方法，方法简便、样品消耗少，时间消耗短，具有通用性，灵敏度可达到1nM，检测线性范围宽，可同时检测ATP适配子和ATP，实验结果表明：利用本方法所获得的ATP适配子的检测范围为：0μM～10μM，当其浓度为10μM时，荧光信号趋于饱和；ATP检测限为：1nM，线性范围为：3个数量级。

附图说明

图1是本发明所述的检测ATP适配子和ATP的方法过程示意图，其中a为ATP适配子，b为多T链，c为CY5标记的DNA互补链，d为ATP；