[发明专利]核酸分子在固态纳米孔中的减速方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸分子在固态纳米孔中的减速方法。

背景技术

基于固态纳米孔器件的DNA单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低成本人类基因测序(在24小时内花费1000美元以下实现单个人的基因组测序)的技术路线之一，成为目前研究和应用探索的热点，除哈佛大学、波士顿大学、布朗大学、加州理工学院、荷兰代尔夫特工业大学等研究小组外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人类基因组测序-1000美元计划，以基于纳米孔器件的测序技术为实现方法，使纳米孔的研究由基础研究开始走向应用(D.Branton，et al.Nature Biotechnology26(10)，1146(2008)；M.Zwolak and M.Di Ventra，Reviews of Modern Physics 80(1)，141(2008).)。纳米孔是指纳米薄膜上直径5-10纳米的介孔。在电解溶液中通过电泳驱动生物分子如DNA穿过纳米孔以实现基于纳米孔器件的单分子探测和分析能力。在纳米孔的有限空间里可以通过各种手段对大量分子进行快速的分析，当高聚物分子穿过纳米孔时，高聚物分子的结构信息和探测的信号特征有一一对应关系。利用该特性可以直接对数千碱基对长度的单链DNA分子进行表征，避免了扩增或标记实验准备环节，使得快速低成本DNA测序技术成为可能。目前阻碍这一技术长足发展的最大困难在于在电场驱动电压下，DNA穿孔速度过快，超出了通用仪器的分辨率，从而无法实现对单碱基的差别识别。

目前国际上较为常用的实验技术是在纳米孔两端加一个电压，通过电场驱动，使DNA分子从孔一端电泳通过纳米孔，在外电路收集的离子电流会出现一个突然下降，电流的突然下降值和阻滞时间，可以对应DNA的生物学信息。但是单纯使用电场调节，DNA的穿孔速度太快，基本在一个碱基一微秒的量级，而目前仪器的最小分辨率为4微秒，也就是说，如果想要区别不同碱基之间的差别，通过现有手段，时间分辨率是无法达到的。要提高时间分辨率，就必须使DNA分子的穿孔时间延长，有效减慢DNA在孔中的运动速度。美国Boston College的Amit Meller等人通过改变Cis和Trans腔填充的溶液盐浓度，可以在5nm的SiN纳米孔中，实现DNA分子毫秒量级的穿孔过程(M.Wanunu，W.Morrison，Y.Rabin，A.Y.Grosberg and A.Meller，Nature Nanotechnology，5，160，(2010))。但是他们对产生这种现象的机理解释不清楚，而且他们使用的纳米孔很小，DNA与纳米孔壁之间的相互作用可能会起作用，而这对实验的可控性大打折扣。而且直径很小的纳米孔在实验实现起来非常困难，成功率很低。美国哈佛大学的Mark等人通过快速改变电场方向的方法，可以使通过纳米孔的DNA分子再次被捕捉，重新返回并再次穿过纳米孔，实现部分的控制DNA在孔中和孔附近的运动(M.Gershow，J.A.Golovchenko，Nature Nanotechnology，2，775(2007))。但是这种方法实验条件繁琐，成功率很低，可控性不好，很难实现真正意义上的实用价值。美国阿肯色大学的Jiali Li等通过在溶液中加入甘油，可以增加DNA的穿孔时间，但是实验条件要求非常苛刻，对实验技术要求很高(D.Fologea，J.Uplinger，B.Thomas，D.S.McNabb，and J.L.Li，Nano Letters 5，1734(2005))。而且随着甘油的增加，导致溶液粘滞系数增加，DNA穿孔阻滞电流值幅度下降，这样测试的信噪比下降，导致测量误差增大。另外可以通过降低电压，使DNA穿孔速度减慢，但是电压降低导致电流信号降低，信噪比变差，导致测量非常困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米孔测序法中降低核酸分子穿孔速度的方法。

本发明所提供的降低核酸分子穿孔速度的方法，是基于现有的固态纳米孔测序法，包括下述步骤：将待测的核酸分子加入到盛有电解液的纳米孔测序装置中，所述纳米孔测序装置包括：设有正极和负极的电解池、以及分隔所述电解池正极和负极的固态纳米孔薄膜，所述待测的核酸分子置于所述电解池的负极腔室，测定时在正极和负极间施加电压；其改进在于：测定时同时引入一个压强外场作为电场的反向外场，从而实现核酸分子的穿孔减速。

本发明中所述核酸分子包括双链或单链DNA、RNA以及肽核酸。

所引入的压强外场产生的压强可为0.5-2.5个标准大气压。