[发明专利]海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记及其辅助育种方法

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记及其辅助育种方法。 

背景技术

我国的扇贝养殖业在经过最初阶段的蓬勃发展以后，逐渐暴露出了许多亟待解决的问题。长期的近亲繁育、累代养殖导致了近交衰退，使得海湾扇贝生长缓慢、抗逆性降低。近年来环境恶化尤其是夏季高温使扇贝机体代谢紊乱，经常发生大规模死亡事件，造成巨大经济损失。因此，加快育种核心前沿技术的研究和抗逆优良品种的选育已成为保障扇贝养殖业持续发展的关键。但由于目前国内外对贝类抗热机理及抗热功能基因的研究较少，缺乏抗热相关的分子标记，导致贝类抗热品种培育的研究进展缓慢，很大程度上制约了扇贝养殖业稳定、健康和可持续发展。 

金属硫蛋白是一类低分子量、富含巯基和能螯合金属离子的蛋白质，在机体内行使多种功能，例如参与生物体内必需金属元素的调节和非必需金属元素的解毒作用，活性氧的清除以及机体生长、发育、生殖、衰老、肿瘤发生、免疫、应激反应等生理生化反应。有研究表明，生物体受到热胁迫时若干基因表达上调，其中金属硫蛋白作为氧化还原系统的组分反应尤为剧烈。研究表明金属硫蛋白能够广泛清除包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基(-HO)在内的ROS类物质，是一种内源性抗氧化剂，同时它能进一步调控其他抗氧化酶的表达，从而协助机体对抗氧化胁迫。目前关于贝类金属硫蛋白的研究多集中在它对重金属调控及活性氧清除等方面，但其多态性与贝类抗热力强弱之间的关系研究仍未见报道，因此寻找扇贝金属硫蛋白基因的多态性，并研究多态位点在耐热相关不同种群中的分布特征，将为研究和利用金属硫蛋白基因作为潜在的抗热性标记辅助选择的候选基因奠定基础。 

发明内容

本发明的目的在于一种海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记及其辅助育种方法。 

为实现上述目的，本发明采用技术方案为： 

一种海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记，湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记为序列表SEQ ID No.1碱基序列所示，起始密码子上游第337个碱基A为抗热基因位点。 

海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记的获得，按如下步骤获得： 

1)海湾扇贝金属硫蛋白基因启动子区部分序列的克隆；以海湾扇贝闭壳肌的总DNA为模板，根据已知的金属硫蛋白基因序列在启动子区设计引物AiMT1pF和AiMT1pR扩增得到DNA序列，待用；AiMT1pF 5′-atgtaagggcacttatgcttgatctttagt-3′和AiMT1pR 5′-agcagtcaggaccagcacagcca-3′； 

2)抗热相关金属硫蛋白基因标记的筛选；对来自抗热群体和热敏感群体的各6个个体的12个克隆进行测序，其多态性位点为-488C/T，-450A/C，-447G/C，-440A ins-del，-431T/C，-430G/A，-428A/T，-375T/C，-363T/G，-337A/C，-311T/A，-310A/T，-298G/T，-265A/G，-253A/G，-251T/C和-118C/T；再提取50个热敏感个体和50个抗热个体的基因组DNA后，针对-375T/C位点多态，首先PCR扩增金属硫蛋白启动子区序列，然后选用Mse I对PCR产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，得-375T/T，-375T/C和-375C/C 3种基因型，以-337A/C位点多态，利用Bi-PASA PCR进行分析，琼脂糖凝胶电泳后，得-337A/A，-337A/C和-337C/C 3种基因型，经Chi-square Test分析，-337A/A个体在抗热群体中出现的频率显著高于敏感群体，即-337A/A为抗热相关的金属硫蛋白基因标记。 

海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记辅助育种方法，以在抗热群体中高频出现的金属硫蛋白基因型作为抗热相关金属硫蛋白基因标记，将携带这种抗热相关基因标记的海湾扇贝进行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的金属硫蛋白基因启动子区序列，研究其多态性；同时进行热胁迫处理实验，研究抗热相关金属硫蛋白基因标记的遗传规律及其与海湾扇贝耐热能力的关系，从中筛选出既带有抗热相关金属硫蛋白基因标记，耐热能力又显著提高的贝苗进行多代繁殖和培育后即可建立抗热新品种。