[发明专利]猪PPARδ基因5’调控区作为脂肪沉积性状的遗传标记

说明书

技术领域

本发明涉及猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与猪的脂肪性状相关基因PPARδ5’调控区片段的克隆及其作为猪脂肪性状遗传标记与应用。 

背景技术

分子标记辅助选择(MAS，marker-assisted selection)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。分子标记直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织各个发育阶段均可检测到，不受季节环境限制；多态性丰富，数量多；大多数为共显性，能区别纯合体和杂合体。因此，分子标记辅助选择具有高准确性，可用于早期选种，缩短世代间隔。与常规育种相结合，可大大加快育种进程。 

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)标记是同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象，它具体是指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等，被公认为是最新的第三代DNA分子标记。 

核激素受体超家族过氧化物酶增殖体激活受体(Peroxisome Proliferators-Activated Receptor，PPAR)属于类固醇/甲状腺/维甲酸受体超家族，共有三种亚型(PPARα、PPARγ、PPARδ)，在调控脂肪细胞分化和调控多种代谢(糖、脂肪、能量代谢等)中起重要作用。PPARα、PPARγ主要在肝脏和脂肪组织中表达，而PPARδ在多个组织中均有表达。与PPARα、PPARγ相比，PPARδ是三个亚型中研究最不透彻的基因(Ehrenborg和Krook，2009)。 

在人巨噬细胞中PPARδ激动剂可促进胆固醇积累，同时在肥胖动物模型提高血清高密度脂蛋白，降低三酰甘油水平(Vosper等，2001；Leibowitz等，2000；Oliver等，2001)。对肥胖、有胰岛素抵抗伴血脂紊乱的印度恒河猴的研究发现给予选择性PPARδ激动剂GW501516以后，高密度脂蛋白增加，三酰甘油和胰岛素水平降低。PPARδ可降低体重、脂滴数量和大小、三酰甘油和脂肪酸，同时选择性的激活脂肪酸氧化和能量解偶联相关基因。 

有学者研究证实，猪PPARδ基因是一个很重要的候选基因，它参与了软骨的生长发育和脂肪的代谢，未来对PPARδ的研究空间还相当大。PPARδ基因在瘦肉型皮特兰和相对脂肪型德国长白猪差异表达，其中在瘦肉型皮特兰品种中的表达量显著高于相对脂肪型长白猪(Ponsuksili等，2007)；在Mangalitsa×皮特兰F2代和德国商业长白猪群中PPARδ单体型和背膘厚之间存在显著关联，在Mangalitsa×皮特兰F2代中单体型4具有增加背膘厚效应，而在德国商业长白猪群中单体型5具有降低背膘厚效应。有趣的是，单体型4可增加PPARδ在肝脏组织中的mRNA表达水平，而单体5降低PPARδ的mRNA表达水平(Meidtner等，2009)。 

发明内容

本发明目的在于克隆猪PPARδ基因5’调控区DNA片段，寻找SNP位点，并建立相应的SNP检测方法，分析其与猪脂肪沉积性状的关系，为猪脂肪沉积性状的标记辅助选择提供有用的遗传标记。 

本发明通过以下技术方案实现： 

本发明获得了大白猪和梅山猪PPARδ基因5’调控区568bp的序列，其DNA序列如序列表SEQ IDNO：1(大白猪)和SEQ ID NO：2(梅山猪)所述，通过2个猪种的上述序列进行Cluster W比对提供了位于该扩增片段内部的1处核苷酸多态性(SNP)，其SNP位点如图3所示。 

突变位点具体在以转录起始位点记为0处起，上游655bp处，以下凡涉及到此突变位点都记为A655/G655。 

选择中国地方猪种梅山猪和外来的欧洲大白猪为实验材料，从猪血液中提取基因组DNA，根据猪PPARδ基因5’侧翼调控序列设计如下引物： 

正向引物F：5’TCAAAGGCAAGGAGGTTA3’。 

反向引物R：5’CAGCACAGTTTCCTCCAG 3’。 

利用该引物进行PCR扩增，PCR产物纯化，克隆测序，序列比对分析。 

本发明获得了一种筛选的与猪脂肪沉积性状相关的遗传标记，它的核苷酸序列如下所示：