[发明专利]一种检测一氧化氮的超高灵敏荧光探针

说明书

技术领域

本发明涉及一类检测一氧化氮的高灵敏度萘酰亚胺类荧光探针。 

背景技术

一氧化氮在生命科学中扮演重要角色，是一个重要的信使分子。自20世纪80年代，科学家们发现在生物体生命活动中会产生一氧化氮分子。一氧化氮不仅具有免疫调节、神经传递、血压生理调控和血小板凝聚的抑制等生理功能，而且还与很多疾病，包括基因突变、癌变、动脉硬化等疾病密切相关。然而，生物体中产生的一氧化氮其生成量较少并且半衰期较短，对其进行实时、原位、定量的检测，将有助于我们进一步了解一氧化氮的生理功能，有助于了解某些疾病的致病原因，并最终找到合适的治疗方法。 

目前对一氧化氮的检测方法主要有电化学法、比色法、质谱法、顺磁法。为了实现对生物样品中产生的一氧化氮进行实时原位的检测，近年来利用荧光探针的荧光检测法表现出了独特的优势：荧光探针对生物体毒性低，不损伤样品细胞，通过与常规监测仪器--荧光显微镜结合对一氧化氮实现原位的检测。目前对一氧化氮进行识别的荧光团主要有荧光素、罗丹明、BODPIY、菁类染料等，其中荧光素DAF-2系列和罗丹明DAR-2系列是目前主要商品化(InvitrogenTM)的一氧化氮检测荧光探针，然而其合成制备工艺比较繁琐，致使其成本较高，价格昂贵，不利于广泛推广使用。 

目前尽管对生命体中一氧化氮的产生和作用机理进行了相应的研究探索，然而，由于一氧化氮的产生量较少、寿命较短，并且仅仅在特定的细胞器中产生。对其进行原位的检测能更好的了解一氧化氮在生命活动中的作用，以及其作为信使分子对生物大分子的调控作用，因此急需设计低成本、高灵敏度的一氧化氮荧光探针。尤其是近年来荧光成像显微技术的发展，而基于萘酰亚胺荧光发色团的一氧化氮荧光探针却很少，并且在国际上尚未报道。为了方便对一氧化氮的实时原位的检测，急需研究、开发具有实用性的高灵敏度一氧化氮探针。 

发明内容

本发明提供了一类检测一氧化氮的萘酰亚胺类荧光探针。其结构通式如(I)所示： 

本发明的目的之二是提供如下的方法来实现： 

该萘酰亚胺类荧光探针的合成方法按如下步骤进行： 

a、以等摩尔量的4-溴-1，8-萘酐与邻硝基对苯二胺为原料，溶解于乙二醇单甲醚中，加热至120℃，反应5小时后将反应液倒入水中，抽滤，减压干燥，得到淡黄色固体。 

b、将a步骤所得到的淡黄色固体溶于无水DMSO(二甲基亚砜)中，加入淡黄色固体等摩尔量的取代的伯胺，加热回流5小时，将反应液倒入水中，抽滤，减压干燥，得到黄色固体。伯胺可以是丙、丁胺、二甘醇胺、2-(N-甲基)哌嗪乙胺、2-吗啉乙胺、2-氨基乙基三苯基磷或3-氨丙基三苯基磷。 

c、将b步骤所得到的黄色固体溶于四氢呋喃和甲醇的混合液中，在2.5MPa的氢气和催化剂催化下，室温搅拌24小时，得到荧光探针产品。四氢呋喃∶甲醇＝5∶1，催化剂为Pd/C、雷尼镍、Fe/HCl或氯化亚锡。 

上述萘酰亚胺类荧光探针的制备反应式如下： 

本发明的萘酰亚胺荧光探针用于化学模拟生物体系中检测一氧化氮分子，以及活细胞和组织切片中的一氧化氮的分析检测和荧光成像分析。活细胞为Hella细胞株、MCF-7细胞株、RAW264.7细胞株等。 

本发明的萘酰亚胺荧光探针具有的特征如下： 

该探针的激发波长在400-460nm范围内，对溶剂极性不敏感，化学稳定性好；探针分子对一氧化氮具有较高的选择性，其他活性分子如H₂O₂、单线态氧、过氧亚硝酸根等对其无干扰，并且还具有较高的灵敏度，其灵敏度在0.5-2nmol范围；通过选用不同类型的伯胺，以便调节探针的溶解性和pH，以改善其溶解性和细胞渗透性，该荧光探针对细胞本身以及生物 体无毒副作用，适用于细胞和生物组织中一氧化氮的检测。 

本发明的重要贡献在于合成了一系列检测原生性一氧化氮的萘酰亚胺类荧光探针，其具有较长的发射波长(530nm)可以避免细胞或组织的自发荧光的干扰，提高成像深度，减少对生物组织的光损伤；本发明中探针的设计机理是基于光诱导的电子转移机理，并且合理的调节基团，实现了高选择性、高灵敏度的检测细胞中原生的一氧化氮；通过细胞成像实验，成功的观测到线粒体和溶酶体中均存在一氧化氮，这为一氧化氮的病理学研究提供了直观而又简捷的生物检测试剂。 

附图说明

图1是本发明中荧光探针(实施例5)对pH的响应图。