[发明专利]神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤

权利要求书

1.神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，其特征是，它按如下步序进行：

(1)转基因神经干细胞制备，将构建的重组逆转录病毒载体pLNCX2-GDNF的质粒包装并感染神经干细胞，制备转基因干细胞GDNF-NSC_s。

(2)脊髓损伤模型制作，按照Tator脊髓损伤制作法，将大鼠椎管打开夹击并缝合护理，制作脊髓损伤动物模型。

(3)斜板实验，术后动物置于一斜板让其静止，记下斜板与水平面夹角度数。

(4)开放平面场地实验，手术动物置于一开口圆盆，让动物爬行于其中，观察动物的运动及其协调情况并打分。

(5)工程细胞的标记，转基因神经干细胞加入Hochest原液，经孵育、清洗，并于冰中待移植。

(6)细胞移植，转基因神经干细胞NSCs-GDNF移植大鼠损伤的脊髓并缝合肌肉、皮肤和护理。

(7)组织样本的获取，过度麻醉动物并作心脏灌注，取出损伤的脊髓经固定行冷冻水平切片，黏贴于经铬矾明胶包被的玻片备用。

(8)脊髓损伤面积观察，使用免疫酶染色法，将做好的组织片经GFAP单抗染色显示脊髓损伤空洞面积。

(9)转基因神经干细胞在体内的存活观察，用免疫组织荧光染色法，把经细胞核染料标记的脊髓标本行神经干细胞标记分子染色，观察移植细胞的存活。

(10)转基因神经干细胞在体内的迁移，细胞核染料标记的干细胞在移植大鼠损伤的脊髓4周后的迁移情况。

2.根据权利要求1所述的神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，其特征是：所述步序(1)转基因神经干细胞制备(见发明专利“胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建”，申请号：201210016282.5)，首先构建目的基因胶质细胞源生神经营养因子GDNF与逆转录病毒载体pLNCX2的重组体，用包装细胞pT67包装，G418筛选阳性克隆。用NIH3T3测定病毒滴度并选取病毒滴度最高的细胞克隆上清液感染胚胎神经干细胞(取自14.5天怀孕清洁级SD大鼠大脑皮质)，经G418筛选获得胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞GDNF-NSC_s。

3.根据权利要求1所述的神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，其特征是：所述步序(2)脊髓损伤模型制作，按照Tator脊髓损伤制作法，取200克清洁级雌性SD大鼠，2％的戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔麻醉动物约15-20分钟，于背部T8处去毛发、消毒、切开皮肤、分离肌肉、暴露椎管、咬去T8脊突直至脊髓充分暴露，用动脉夹夹击脊髓五秒钟后，生理盐水洗伤口，补抗菌素、生理盐水和10％葡萄糖液各1ml，并作人工护理。

4.根据权利要求1所述的神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，其特征是：所述步序(3)斜板实验，动物术后9天或细胞移植一个月后，将动物置于一斜板使其静止5秒钟，并记下斜板与水平面夹角度数。

5.根据权利要求1所述的神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，其特征是：所述步序(4)开放平面场地实验，把手术动物置于一开口圆盆(底部为带条纹的地板)，轻敲盆壁使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节，以及行走、躯干运动及其协调情况。

6.根据权利要求1所述的神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，其特征是：所述步序(5)工程细胞的标记，转基因神经干细胞GDNF-NSC_s加入Hochest原液(5μl/ml)，37℃、5％CO₂孵育箱饱和湿度孵育1小时，神经干细胞基础培养液清洗细胞三次后计数备用。

7.根据权利要求1所述的神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，其特征是：所述步序(6)细胞移植，脊髓损伤大鼠成模型后，打开椎管并使受损的脊髓充分暴露，将微玻璃管固定于立体定位仪并吸取混匀后的4μl(干细胞含量：1x10⁷/ml)干细胞液，使微玻璃管进入脊髓损伤组织1mm深，以1μl/1分钟的速度将细胞液推进损伤脊髓中心。缓缓退出微玻管以免细胞渗出。