[发明专利]一种鉴别冬虫夏草的线粒体基因序列和方法

权利要求书

1.一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的线粒体基因序列，其特征是冬虫夏草寄主昆虫当雄蝙蝠蛾幼虫干标本经基因组DNA提取、通用引物设计、PCR扩增、序列测定、数据分析、选定高变异率区、特异引物设计后PCR扩增得到的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的操作方法，其特征在于包括如下步骤：

1)取冬虫夏草寄主当雄蝙蝠蛾幼虫干制标本。挑选保存完好，无虫蛀霉变的干标本，将干标本剪下一小段后，剪开取出内容物，用75％酒精擦拭干标本体壁内、外侧2-3次以消除外源物质的污染。

2)将样品置于TE(10mM Tris-HCL，200mM EDTA，50mM NaCl，pH 9.0)中浸泡48小时后，取出浸泡回软后的材料采用酚/氯仿法提取蝠蛾总DNA。

3)设计相关引物21对，覆盖了线粒体基因组所有序列。

4)根据21对引物进行PCR扩增及PCR扩增产物的序列测定和拼接，得到完整的当雄蝙蝠蛾的线粒体基因组序列。

5)结合GenBank已有的40个以及本实验室自行测定的5种共45种鳞翅目昆虫线粒体基因组序列，比对后以Bombyx mori的基因组注释为基准获得鳞翅目昆虫线粒体基因组蛋白编码基因高变的区域。

6)依据图1结果，选择变异率最大且连续性最好的区域，分别对应于蛋白编码基因nad2、cox3和atp6。据此设计三对引物分别为

ND2F：ATTTTCGTGCTTCTTA和ND2R：TTGAAGATTATTAGTT；

ATP6F：GTAAGTATTGGTCTCT和ATP6R：ATGGGTGATTTTGATT

OX3F：CCAAGGAACACCAAAT和COX3R：GTAATGAAAATGGAAT。

7)三对引物的扩增体系为50μl，内含0.5μl TaKaRa LA Taq(5U/μl)，5μl10×LA PCR Buffer(Mg2+Plus)，8μl dNTP，上下游引物各2μl，2μl(含20-50ngDNA)模板溶液。

8)三对引物PCR扩增的反应条件为预变性94℃2分钟；35个循环，每个循环包括变性94℃20s，退火48-55℃1m，延伸68℃1.5m；然后延展72℃10分钟。

9)PCR扩增产物采用3730测序仪双向测通，得到三个基因的序列长度分别为：nad2 1158bp；atp6 977bp；cox3 1307bp。

10)取被检样品提取基因组DNA，采用上述三对特异引物进行PCR扩增，如果可以分别得到3个蛋白编码基因的序列，且通过Mega软件计算三个基因联合数据集中核苷酸序列差异小于1-1.5％，即为同种不同个体之间的变异率，表明其为真的冬虫夏草，且其寄主昆虫为当雄蝙蝠蛾；若＞6％，即为同属不同种之间的变异率，表明其为真的冬虫夏草，但其寄主昆虫为当雄蝙蝠蛾之外的蝠蛾属昆虫。