[发明专利]检测叶绿体DNA鉴定三系不育水稻细胞质类型的方法

说明书

技术领域

本项发明涉及一种检测叶绿体DNA鉴定三系不育水稻细胞质类型的方法。

背景技术

1966年，日本学者新城长友育成了由细胞质和细胞核共同控制的BT 型(以印度籼稻品种Chinsuran BoroⅡ为细胞质供体, 以粳稻品种作核供体选育而成) 三系不育系。1970年，袁隆平、李必湖等在海南野生稻中发现一株雄性不育株，通过核置换培育成了“野败”型三系不育系。 随后以海南红芒野生稻与籼稻品种莲塘早杂交选育成了红莲型三系不育系。再后育成了K型、冈型、印水型等。由于这些细胞质除与雄性不育有关外，没有细胞质标记性状，无法通过普通生物学性状对其细胞质进行区别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测叶绿体DNA鉴定三系不育水稻细胞质类型的方法，通过简单的对三系不育水稻叶绿体DNA的PCR扩增产物进行克隆测序即可鉴定三系不育水稻的细胞质类型。

本发明所述的检测叶绿体DNA鉴定三系不育水稻细胞质类型的方法，包括以下步骤：

（1）提取三系不育水稻叶片中的叶绿体DNA；

（2）用叶绿体引物cp1、cp2、cp3、cp9对步骤（1）提取的叶绿体DNA进行PCR扩增；

（3）对所得PCR扩增产物进行克隆测序；

（4）将所得碱基序列与三系不育水稻叶绿体DNA分子指纹对比，确定三系不育水稻细胞质类型。

本发明所述的检测叶绿体DNA鉴定三系不育水稻细胞质类型的方法，在鉴定三系不育水稻细胞质类型时只需对叶绿体引物cp1、cp2、cp3、cp9的PCR扩增产物进行克隆测序，再与叶绿体DNA分子指纹进行比较即可简单、高效的鉴定出三系不育水稻的细胞质类型。

具体实施方式

本发明以32份典型籼稻和典型粳稻细胞质为对照，对不同来源的17个三系不育系叶绿体DNA序列进行分析，发现不同类型不育细胞质具有特征性碱基或碱基序列，以叶绿体引物cp1、cp2、cp3、cp9的扩增序列差异建立了野败型、红莲型及BT型三种叶绿体DNA分子指纹。

以常规水稻日本晴为对照，对V20A等三系不育系的叶绿体DNA的PCR扩增产物进行克隆测序，其序列结果见表1。

表1

注：“-”表示缺失该序列。

表1中所述叶绿体引物

cp1：正向序列5-gtggacctgactccttgaa-3，反向序列5-agccgaggtcgtggtaa-3；

cp2：正向序列5-gcagcccaagcgagact-3，反向序列5-aaggctcggcgatactg-3；

cp3：正向序列5-ttttctcctcatacggct-3，反向序列5-tagtctgttctattcgtccc-3；

cp9：正向序列5-tcaagcatctcggttcg-3，反向序列5-cgcctcattagcccatac-3。

所述三系不育水稻叶绿体DNA分子指纹：

野败型细胞质：cp1扩增序列第248-316位缺失、cp2扩增序列第163-194位为I-32片段、cp3扩增序列第220-225位为gttgag、第595位为t、cp9段扩增序列第540-543位为gctt；

红莲型细胞质：cp1扩增序列第248-316位缺失、cp2扩增序列第163-194位为I-32片段、cp3扩增序列第220-225位缺失、第595位为g、cp9扩增序列第540-543位为gctt；

BT型细胞质：cp1扩增序列第248-316位为I-69基因片段、cp2扩增序列第163-194位缺失、cp3扩增序列第220-225位缺失、第595位为t、cp9扩增序列第540-543位为gctt；

所述I-32片段表示插入片段序列：ttaacaaatt、cttagagtat、ttctggtaga、at；所述I-69片段表示插入片段序列：ttactttttt、tcagaatcct、atttttgttc、ttatacccat、gcaatagaga、gcgagtggga、aaagggagg

检测结果为：V20A、T98A、K17A为野败型不育水稻，粤泰A为红莲型不育水稻，T1A、6A、199A为BT型不育水稻。