[发明专利]一种聋病易感基因SLC26A4 IVS7-2A>G荧光检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G及Amelogenin基因座的荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。 

背景技术

SLC26A4基因与弧立的大前庭水管综合征及Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)的关系密切，临床上表现为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。通过颞骨CT扫描可以得出结论，但目前由于设备和专业人员的限制，中国大部分地区的医院不能进行高分辨率的颞骨CT扫描，导致许多地区无法诊断大前庭水管综合征。 

通过对SLC26A4基因的检测，则可以在全国范围内实现对80％以上大前庭水管综合征的准确诊断，并先于CT检查发现和确诊大前庭水管综合征，这一方法可以避免放射线检查的辐射问题，更易为患者家属接受，并且由于基因诊断操作能够批量进行，可以在大标本范围内进行筛查。大量研究表明，存在于中国人群突变热点区域为：SLC26A4基因外显子8的侧翼序列的IVS7-2A＞G。 

目前常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。 

采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带荧光标记物的引物对SLC26A4基因的IVS7-2A＞G位点特异性的扩增，并在此引物中掺入核酸类似物提高引物的Tm值，进一步增强引物的特异性，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对耳聋基因位点的检测。该方法灵敏度高、判读清晰准确，仅需采取少量血样或口腔拭子样本，即可进行检测，采样方便尤其适合新生婴幼儿样本的采集。 

发明内容

本发明目的是提供一种聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G荧光检测试剂盒。 

为了实现上述目的，采取的技术方案：一种聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂； 

所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs的混合物，Taq酶，2对引物混合物以及超纯水； 

所述扩增后试剂包括：用于基因分型的对应于SLC26A4基因突变热点IVS7-2A＞G检测和Amelogenin性别鉴定基因座的等位基因标准物的混合物和内标ROX-300； 

使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，Taq酶的用量为0.1-0.4U/μL，2对引物混合物中的单对引物终浓度为0.2-0.4μM。 

使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增SLC26A4基因的IVS7-2A＞G和Amelogenin基因座。 

用于SLC26A4基因IVS7(-2)位点A＞G突变检测的引物为：SEQ NO.01和SEQ NO.02.X。 

SEQ NO.02.X为下列掺入了LNA核苷的引物中的任意一条(LNA核苷以黑体字表示)： 

SEQ NO.02.1：5’-G TTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3’ 

SEQ NO.02.2：5’-GTTTTTAACATCT TTGTTTTATTTAG-3’ 

SEQ NO.02.3：5’-GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTT G-3’。 

用于Amelogenin基因座检测的引物为：SEQ NO.03：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’、SEQ NO.04：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。 

所述的2对引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料可以为相同或不同的荧光素。 

所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。