[发明专利]一种聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T荧光检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T及Amelogenin基因座的荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。 

背景技术

世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80％患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80％。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。 

药物的耳毒性是导致语前听力损失的一个重要因素，部分与线粒体12S rRNA基因突变有关，在中国群体中发现了12S rRNA基因1494C＞T突变与药物性耳聋的关系，目前至少已经发现了三个大的家系是由于1494C＞T突变导致的。1494C＞T突变者在出生时往往听力正常，很难通过听力筛查而被提前发现和预测，却存在因耳毒性药物的使用而发生听力损失的隐患。 

目前常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。 

采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带荧光标记物的引物对12S rRNA 1494C＞T位点特异性的扩增，并在此引物中掺入核酸类似物提高引物的Tm值，进一步增强引物的特异性，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对耳聋基因位点的检测。该方法灵敏度高、判读清晰准确，仅需采取少量血样或口腔拭子样本，即可进行检测，采样方便尤其适合新生婴幼儿样本的采集。 

发明内容

本发明目的是提供一种聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T荧光检测试剂盒。 

为了实现上述目的，采取的技术方案：一种聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂； 

所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs的混合物，Taq酶，2对引物混合物以及超纯水； 

所述扩增后试剂包括：用于基因分型的对应于12S rRNA 1494C＞T检测和Amelogenin性别鉴定基因座的等位基因标准物的混合物和内标ROX-300； 

使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，Taq酶的用量为0.1-0.4U/μL，2对引物混合物中的单对引物终浓度为0.2-0.4μM。 

使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增12S rRNA 1494C＞T和Amelogenin基因座。 

用于12S rRNA 1494C＞T突变检测的引物为：SEQ NO.01和SEQ NO.02。 

SEQ NO.02为掺入了LNA核苷的引物(LNA核苷以斜体字表示)： 

SEQ NO.1：5’-AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’ 

SEQ NO.2：5’-GACACACCGCCCGTCTCT-3’ 

用于Amelogenin基因座检测的引物为：SEQ NO.03：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’、SEQ NO.04：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。 

所述的2对引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料可以为相同或不同的荧光素。 

所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。