[发明专利]MRSA中QacC基因的检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒剂QacC基因携带情况的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

随着抗菌药物的广泛应用，细菌的耐药性越来越严重，并出现了多重耐药株。研究发现，多重耐药菌株中的主动外排系统能够显著降低细胞内抗菌药物的浓度，同时由于主动外排系统转运底物的广泛性，使细菌呈现对多种化学结构完全不同的抗菌药物高度耐药。进一步研究表明，细菌的主动外排是导致细菌产生多重耐药的主要原因。研究认为MRSA的耐药可能跟细菌获得主动外排基因有关，现已发现MRSA中存在多种主动外排系统。Markham等早在1996年就推测外排系统在MRSA多重耐药机制中发挥重要作用。金黄色葡萄球菌还存在qac，smr等多种外排系统。Qac基因家族中发现有QacA，QacB，QacC，QacD，QacE等基因。细菌获得Qac基因可表现对胺类、胍类、腙类消毒剂也耐药。在Qac家族中，除对消毒剂耐药外，对多种抗菌药物存在高耐药率。

QacC基因可从金葡菌小质粒和大质粒如214kb的pSK89、pSK108和4718kb的pSK41中分离得到；在凝固酶阴性葡萄球菌的结合型质粒PNVH99中也发现它的存在。后来从食品中分离得到的葡萄球菌经核酸测序证明，qacC与sm r仅有一个核苷酸的不同。qacC基因编码的蛋白含有107个氨基酸，属于原核多重耐药家族，这个家族中还包括大肠埃希菌编码蛋白Ebr和革兰阴性杆菌的整合子编码蛋白QacE。该家族的蛋白均有四个跨膜片段，它们依靠质子泵的动力对季胺类化合物和溴化己啶等消毒剂耐药。

目前检测QacC基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。

发明内容

本发明的目的是提供耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒剂QacC基因携带情况的PCR检测引物及使用该引物的检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一组MRSA中QacC基因的检测引物，其特征在于，包括：

(A).QacC基因正向引物：5’-tgcaacacctaccactaaatataactt-3’；

(B).QacC基因反向引物：5’-cgaaactacgccgactatga-3’。

本发明还提供了一种MRSA中QacC基因的检测方法，其特征在于，采用上述MRSA中QacC基因的检测引物，具体步骤为：

第一步：取经培养后鉴定为MRSA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacC基因的金黄色葡萄球菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacC序列，构建携带QacC基因的重组质粒为阳性对照品；

第二步：用无菌水分别配制浓度为5-15umol/L的QacC基因正向引物溶液、浓度为5-15umol/L的QacC基因反向引物溶液及浓度为5-15umol/L的QacC基因检测探针溶液；QacC基因正向引物的序列为：5’-tgcaacacctaccactaaatataactt-3’，QacC基因反向引物的序列为：5’-cgaaactacgccgactatga-3’，QacC基因检测探针的序列为：FAM-gcaacttgggcggga-MGBNFQ；

第三步：在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix 10-15ul和第二步得到的QacC基因正向引物溶液0.1-1ul、QacC基因反向引物溶液0.1-1ul、QacC基因检测探针溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各0.1-1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60℃保温1-3分钟，80-100℃保温1-3分钟，然后运行30-50个循环，每个循环包括在80-100℃保温10-20秒，再在50-70℃保温0.5-1.5分钟；

第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带QacC基因。

本发明是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中是否还有耐消毒剂QacC基因的检测，细菌一旦获得此基因即可对现用的消毒剂耐受，使消毒剂失效，通过检测了解细菌中QacC基因的携带情况，有利于对含有耐消毒剂基因的菌株的监控，防止菌株继续流行，同时从科研角度对其耐药机理的进一步了解还有利于新的灭菌制剂的研制开发。