[发明专利]利用热激和四环素调控的ntCre/LoxP删除系统、重组表达载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.利用热激和四环素双重调控的ntCre/LoxP删除系统，其特征在于：所述ntCre/LoxP删除系统包括ntCre重组酶特异识别的2个LoxP位点和位于2个LoxP位点之间的靶基因部分，所述2个LoxP位点分别为位于靶基因3’端的第一LoxP位点和位于靶基因5’端的第二LoxP位点；还包括HSF70m启动子调控的Rhsf基因表达盒和Om35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒部分，所述Om35S启动子由Rhsf基因调控，所述HSF70m启动子核酸序列如SEQID NO.1所示，所述Rhsf基因核酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述Om35S启动子核酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述LoxP位点核酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述ntCre重组酶基因核酸序列如SEQ ID NO.26所示。

2.根据权利要求1所述的ntCre/LoxP删除系统，其特征在于：所述ntCre/LoxP删除系统是所述第一LoxP位点，靶基因，Om35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒，HSF70m启动子调控的Rhsf基因表达盒和第二LoxP位点顺序串联。

3.根据权利要求1或2所述的ntCre/LoxP删除系统，其特征在于：所述靶基因为抗性标记基因。

4.含有权利要求1-3任一项所述ntCre/LoxP删除系统的重组表达载体。

5.权利要求4所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：将含有HSF70m启动子调控的Rhsf基因表达盒和Om35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒部分连入pVCT2231载体的酶切位点处；

所述pVCT2231载体由pCAMBIA1320载体、pVCT1191载体和pBIN19载体制备，具体步骤为：从pVCT1191载体中克隆nptIIm基因，并在nptIIm基因3’端加上LoxP位点，获得nptIIm-LoxP组件，然后将nptIIm-LoxP组件替换pCAMBIA1302载体上的潮霉素抗性基因hptII，并将含LoxP位点的序列反向插入pCAMBIA1302载体，替换pCAMBIA1302载体的35S启动子和mGFP5基因编码区；同时从pBIN19载体中克隆Pnos启动子，替换pCAMBIA1302载体上调控hptII基因的2×35S启动子，即得pVCT2231载体；

所述pVCT1191载体由pCR2.1-TOPO载体改造而来，具体为，删除pCR2.1-TOPO载体上氨苄抗性基因并自环化连接构建的载体，即pVCT1191载体。

6.根据权利要求5所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，所述pVCT2231载体制备具体步骤为：

(1)将所得nptIIm-LoxP基因连入pMD18-T载体中，得pVCT1202载体，并用SalI和XhoI双酶切所得的pVCT1202载体，琼脂糖凝胶电泳并回收nptIIm-LoxP组件，将回收的nptIIm-LoxP组件连入pCAMBIA1302载体的2个XhoI酶切位点之间，得pVCT2071载体；

(2)克隆的所述Pnos启动子，用Sal I和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收，将所得的Pnos启动子连入所得pVCT2071载体的Xho I和EcoR I酶切位点之间，得pVCT2072载体；

(3)用NotI酶切所得pVCT1202载体，用Klenow Fragment酶补为平末端，再用XbaI酶切，回收含LoxP位点的pVCT1202载体片段，同时用PmaCI和XbaI酶切所得pVCT2072载体，回收含nptIIm基因的pVCT2072载体片段，将回收的pVCT1202载体片段与pVCT2072载体片段连接，得pVCT2231载体。