[发明专利]利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法。

背景技术

木质纤维素广泛存在于植物细胞中，是自然界中含量最多的有机可再生资源，在植物体内，木质素通过化学键与半纤维素连接然后包裹在纤维素之外，形成木质纤维素，木质素与纤维素一起构成植物骨架的主要成分。木质素由于具有各种生物学稳定的复杂键型而不易被微生物降解。要解决如何高效的利用木质纤维素这个问题，关键在于如何降解包裹在纤维素晶体外面的木质素以及半纤维素，从而增加纤维素表面积、使纤维素易于降解和利用。

传统的理化方法大概可以去掉50％的木质素，并使纤维成为非结晶态，但是成本较高，需要昂贵的专业设备并消耗大量的能源，而且容易造成二次污染，而生物预处理具有能耗低、操作简单以及不污染环境等优点，越来越受到人们的重视。

人们发现的能降解木质素的微生物主要是真菌，关于真菌能够降解木质素，大多认为其能产生一些降解木质素酶。现有技术中研究较多，降解能力较强的酶主要有木质素过氧化酶、锰依赖过氧化物酶和漆酶。除了上述3中重要的酶外，其他的如葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶及一些还原酶和蛋白酶等都参与或对木质素的降解有一定的影响。

现有技术中降解木质纤维素的细菌种类很多，放线菌是公认的降解能力较强的一类丝状细菌，包括链霉菌、节杆菌、小单胞菌、诺卡氏菌等。

综上所述，目前人们主要集中在单个菌株的筛选，要么研究木质素降解菌，要么研究纤维素降解菌，尚未发现效果较好的复合菌群。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法。其技术方案为：

一种利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法，本发明筛选了复合菌群，另外也协同白腐菌，还筛选了青贮菌群，以实现棉秆青贮，解决南疆的粗饲料不足，变废为宝，实现种养结合的模式。

包括以下步骤：

(1)降解棉秆木质纤维素降解复合菌系的筛选

1)将从新鲜牛粪为MG0、堆肥为MG1、棉花地耕作层土壤0～40cm为MG2和瘤胃液中取来的样品为MG3，各取5g/mL加入到100ml PCS培养基中，37℃培养，静止，CO₂培养箱中培养。

2)待纤维素崩解以后，再转接到新鲜的PCS培养液中，接种量为10％(v/v)，如此转接数代，淘汰失去分解能力和不稳定的培养物，留下分解能力强的培养物，

定期改变传代方法：每5代，取10mL，离心3500r·min^-1，弃上清液，加10mL无菌生理盐水，悬浮，接种到新鲜的PCS培养基上。待纤维素崩解时间稳定以后，即初步筛选到纤维素分解混合菌群。最后得到降解棉秆木质纤维素效果强、稳定的复合菌系MG0，MG1，MG2和MG3。

蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基成分：蛋白胨、纤维素(棉花秸秆)、酵母膏、NaCL各5g·L^-1，CaCO₃2g·L^-1，K₂HPO₄、MgSO₄各0.5g·L^-1，微量元素溶液0.5mL·L^-1，土壤浸提液(土壤与去离子水以质量比1∶1搅拌混合，过滤，灭菌后备用)100mL·L^-1。微量元素溶液成分(g·L^-1)：硫酸锌0.29，氯化钙0.24，硫酸铜0.25，硫酸镁0.17

(2)青贮复合菌系的筛选

利用MRS培养基对南疆青贮饲料、棉花秸秆与玉米秸秆混个青贮(质量比例1∶1)和棉花秸秆进行青贮，常温，青贮40d。然后称取5g青贮饲料，加入到95mL MRS培养基中进行培养，37℃，静止，CO₂培养箱中培养24h，筛选pH快速降到4.0以下的青贮复合系。然后将pH快速下降到4以下的复合系，进行继续转代培养。直到筛选出pH快速下降到4以下的稳定的青贮复合系。

MRS液体培养基(g/l)：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801mL，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH 6.2-6.4。

(3)白腐菌的培养