[发明专利]一种产生庆大霉素C1a的工程菌及其构建方法

说明书

 

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种主要产生庆大霉素C1a组分的工程菌及其构建方法与应用，可以应用于抗生素制药领域，应用空间较大。具体涉及一种产生庆大霉素C1a的工程菌及其构建方法。

背景技术

小单孢菌是一属能产生多种具有临床价值抗生素的微生物，在先后报道的60种小单孢菌中，就有40多种产生抗生素，其中包括大环内酯类、氨基糖苷类、安莎类和蒽环类等等。小单孢菌不仅可以产生链霉菌所产生的抗生素，还产生庆大霉素(Gentamicin)、西索米星(Sisomicin)、阿司米星(Astromivin)等。小单孢菌有巨大的潜力，日益受到人们的重视。

庆大霉素(Gentamicin，GM)是由放线菌属绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)、棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora）发酵产生的氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革兰阴性菌和阳性菌有较强的抗菌作用。1963年被美国人Weinstein首次发现，1969年被用于临床，它也是我国独立自主研制成功的广谱抗生素。

庆大霉素各组分在结构上很相近，由三个环状结构组成，分别为绛红糖胺，2-脱氧链霉胺和加拉糖胺。根据分子结构的差异可以分为庆大霉素C，庆大霉素A，庆大霉素B和庆大霉素X等。庆大霉素C是主组分，2-脱氧链霉胺分别在4、6位上通过苷键连接绛红糖胺和加拉糖胺。因绛红糖胺C6’上的甲基化程度不同，形成了C1、C2、C1a三个组分。庆大霉素不同组分的抗菌活性因它们与细菌核糖体的亲和力不同而异，最有效的成分为C1a，它的活性略高于C2，而C1与细菌核糖体的亲和力最弱。庆大霉素C1a组分可作为合成抗菌药物依替米星的前体药物，应用空间较大。

庆大霉素的生物合成基因簇已被克隆。根据抗性基因与合成基因连锁的规律，Unwin等用已报道的庆大霉素抗性基因grmA设计引物，以Micromonospora echinospora ATCC15835基因组质粒文库为模板进行PCR扩增，从1000个质粒中筛选到1个阳性克隆，包括38kb的外源片段，其中有28个完整的ORF。其中，gntE基因的功能已经被证实。

gntK基因编码产物与M.olivasterospora中的fms7基因产物有57%的同源性。Fms7催化福提霉素6’位甲基化，使KL1转变为KK1，所以推断gntK为6’-C位甲基化酶基因。同时，庆大霉素与西索米星的化学结构非常相似，推测它们有相似的生物合成路线和相似功能的基因。庆大霉素化学结构中比西索米星多6’-C位的甲基，而在它们生物合成基因的比对中发现，西索米星生物合成基因簇中没有与gntK相似的基因，所以推测gntK为6’-C甲基化酶基因。而庆大霉素C1a在6’-N位甲基转移酶的作用下继续合成庆大霉素C2b。

庆大霉素C1a最常采用的制备方法为从小诺霉素的发酵液中分离得到。该方法通常包括发酵，将发酵液经过过滤得到滤液，滤液经脱色浓缩、浓缩液用大孔吸附树脂吸附、用三种不同比例的乙醇－氨水进行洗脱、解析，解析液经浓缩、喷雾干燥得到庆大霉素C1a。这种方法存在不足之处，例如生产周期长（480小时/批）；生产工艺复杂，树脂吸附后需用混合溶液经过三次洗脱、解析才能得到庆大霉素C1a；混合洗脱剂和解析剂中的乙醇采用蒸馏塔回收，设备复杂，需消耗大量蒸汽；所用大孔吸附树脂的吸附量小；产品含量低（一般为85％－90％）；原材料消耗大，成本高。

另一种生产庆大霉素C1a的方法为筛选庆大霉素C1a高产菌株。通过诱变庆大霉素产生菌绛红小单孢菌，获得庆大霉素C1a高产菌株，通过分离纯化方法得到。但该方法对研究的菌株遗传背景研究不清晰，菌株发酵产物中仍然可能有庆大霉素其他C组分的存在。

发明内容

本发明通过基因工程的方法将负责庆大霉素生物合成C-6位甲基转移酶的编码基因阻断，从而使生产菌不能合成庆大霉素C组分。所得菌株产生的C1a含量高，且菌株遗传背景较清楚，不会发生回复突变。

本发明的目的是提供一种主要产生庆大霉素C1a组分的工程菌。

本发明的另一目的是提供该基因工程菌株的构建方法。

本发明的进一步目的是基因工程菌的应用。

本发明通过框架内删除失活的方法破坏绛红小单孢菌中的gntK基因，主要包括以下步骤：

（1）gntK基因阻断质粒的构建