[发明专利]一种抑制烟草愈伤组织继代培养中褐化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞工程技术领域，更具体涉及一种抑制烟草愈伤组织继代培养中褐化的方法。适用于烟草等茄科植物愈伤组织继代培养中褐化现象的抑制。

背景技术

烟草是茄科烟草属的一年生草本植物，本属约有60种。原产于美洲和大洋洲，中国栽培4种：烟草、黄花烟草、光烟草和花烟草，其中烟草种植面积最大。烟草具有药用、工业用、保腱美容等价值，其中卷烟是烟草的主要产品，从烟叶中提取的蛋白质其营养价值高于任何奶类的蛋白质，而烟碱有杀菌止血的功能，是医院必备的药品。在中国烟叶和卷烟的销量很大，是国家的高积累、高税率商品，在国民经济中占有重要的地位。此外，烟草作为植物组织培养的“模式植物”之一，在植物细胞工程的研究中占有重要地位。有关烟草组织和细胞培养有不少研究和报道。褐变这一在许多木本植物组培中常见的现象，也是烟草组织培养的一大障碍。褐变是指外植体在培养过程中，自身组织从表面培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。为了提高组织培养的成功率及维持愈伤组织较高的新陈代谢活性，必须对褐变现象加以严格控制。

目前，国内外针对烟草组织培养过程中褐变现象的发生及引起褐变的因素有一定研究和报道。烟草细胞继代培养过程中的褐化诱因可归结为两大因素：1.材料的遗传基础及生长发育等内在因子；2.培养方式及条件等外部因子。尽管引起烟草愈伤组织继代培养中褐变的因素很多，但如下这一点是清楚的：选择适宜的培养基，再配合使用一些抗氧化剂，调节外源激素的种类与含量，在适宜的温度及黑暗中培养，方能使愈伤组织处于旺盛生长状态，且能够有效地控制褐变。我们研究发现，固体培养基的凝固情况对愈伤材料生长的影响较大。如果培养基偏软，植物愈伤材料会因沉入培养基中造成缺氧，胞内多酚氧化酶被激活，细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，最终愈伤组织生长不好，直至死亡。如果培养基偏硬，则植物材料吸收水分和养分困难，同样生长不好。培养基的凝固状况(体现为软硬度)与琼脂用量和培养基的pH值有关。在实际操作过程中，培养基的pH值都是在灭菌前调至预定值的，但高温灭菌后由于培养基营养成分发生化学变化，会导致培养基的pH值也随之改变，这是造成高温灭菌后固体培养基凝固不好、甚至不凝固的主要原因之一。调高培养基pH值或增加琼脂用量均可改善培养基的凝固效果。因此在配制培养基时琼脂的用量、培养基灭菌前pH值的设定以及灭菌时如何控制培养基成分的有效性及各营养成分的顺序都是抑制烟草愈伤组织继代培养褐化的关键。另外，向培养基中加入适量吸附剂聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，以吸收愈伤组织生长过程中产生的有毒物质也是抑制烟草愈伤组织继代过程中褐化的一个新思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制烟草愈伤组织继代培养过程中褐化的方法。方法简单易行，操作方便，有效抑制了烟草愈伤组织继代过程中的褐变，效果好，烟草愈伤组织增殖率可达11.29(倍)；另外，该发明为烟草愈伤组织悬浮培养提供了优良的细胞种源。该方法培养的烟草愈伤组织松软，为获得分散均匀的悬浮细胞系提供了良好的条件。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施：

一种抑制烟草愈伤组织继代培养过程中褐化的方法，其步骤是：