[发明专利]表达A型口蹄疫病毒空衣壳重组腺病毒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组腺病毒，尤其涉及表达A型口蹄疫病毒空衣壳的重组复制缺损型腺病毒及其构建方法，本发明进一步涉及该重组复制缺损型腺病毒在制备预防或治疗口蹄疫疫苗中的应用，属于口蹄疫的防治领域。

背景技术

口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。口蹄疫的临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大的经济损失。因此世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的动物传染病。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，其最大颗粒直径为28纳米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个血清型A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，中国流行的口蹄疫主要为O、A、C三种血清型。

口蹄疫病毒各血清之间没有交叉保护，即使是同一血清型的不同亚型之间抗原差异程度也较大，以至于一种亚型的疫苗可能不完全保护同一血清型中其它亚型FMDV的感染，给口蹄疫的防治带来了极大的困难。疫苗接种是成功预防、控制乃至最终消灭口蹄疫的最有效手段。目前用于防治口蹄疫的疫苗主要有合成肽疫苗灭活疫苗和两种。

合成肽疫苗是基于病毒的主要抗原位点，利用病毒的主要抗原位点的一部份氨基酸序列合成具有一定结构的多肽，用于免疫动物诱导中和抗体而达到保护的目的。但是，如果在病毒的主要抗原位点上发生关键氨基酸的突变，就会导致合成肽疫苗免疫保护效力的丧失。

FMD灭活疫苗在消灭欧洲的口蹄疫以及控制世界其他国家的口蹄疫过程中发挥了重要作用。但是，灭活疫苗在生产中需要密闭设施来繁殖有毒力的病毒，存在活病毒逃逸的潜在风险，世界上一些地区FMD的暴发似乎与灭活疫苗中残存的活病毒有关。此外，制备FMD灭活疫苗的抗原未经提纯，含有病毒非结构蛋白，难于进行感染动物和免接种动物的鉴别诊断。如今成为研究热点的口蹄疫候选疫苗包括减毒活疫苗，蛋白质亚单位疫苗，合成肽疫苗，DNA疫苗和重组病毒疫苗等。到目前为止，证明最有效的FMD新型疫苗是人5型复制缺损型腺病毒(Ad5)表达的口蹄疫病毒空衣壳。Ad5作为一个理想的载体的重要原因是因为其免疫动物后不产生针对Ad5的中和抗体，排除了二次免疫的干扰。

鉴于FMD灭活疫苗的上述缺点，国内外研究者都在寻求一种更加安全有效的口蹄疫疫苗。理想的口蹄疫疫苗应具有病毒的完整抗原谱，其免疫原性类似于天然的病毒颗粒，并且没有病毒的核酸，不能自主复制等特点。以缺损型腺病毒(Ad5)为载体的口蹄疫病毒空衣壳疫苗完全满足了上述要求，可被视为病毒减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合，这样既可以避免亚单位疫苗需要佐剂和多次接种注射的缺陷，又可以诱导全面而持久的免疫反应，而且其免疫动物后不产生针对Ad5的中和抗体，排除了二次免疫的干扰。

发明内容

本发明的目的之一是提供编码A型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C；

本发明的目的之二是提供一株携带所述亚基因组P1-2A-3C并能够稳定表达A型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒；

本发明的目的之三是提供一种构建上述重组缺损型腺病毒的方法；

本发明目的之四是将所构建的重组缺损型腺病毒应用于制备成预防或治疗A型口蹄疫的疫苗或试剂。

为了实现上述之目的，本发明首先提供了编码A型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

构建FMD病毒空衣壳的前提是必须保证得到完整、精确的FMDV基因组结构，在此基础上才能正确拼接FMDV的P1-2A和3C亚基因组，否则将对口蹄疫病毒空衣壳的形成造成很大的影响。只有口蹄疫P1-2A-3C亚基因组序列的拼接正确，3C蛋白酶才能充分裂解口蹄疫前体蛋白并完成病毒衣壳组装，这对后期的动物免疫试验的效果会产生重要甚至决定性影响。此外，本发明在拼接口蹄疫P1-2A-3C亚基因组序列时加入了非结构蛋白2B片段，该片段起到了免疫佐剂作用，能提高口蹄疫病毒空衣壳对本动物尤其是猪的免疫保护效果。还需要说明一点的是，在拼接编码口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组时，本发明中所用的A型FMDV序列与国内外在拼接编码口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组时所用到的FMDV序列不属同一基因型。