[发明专利]检测三聚氰胺的化学发光试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体地，本发明提供了一种三聚氰胺的化学发光定量测定试剂盒的制备方法。

背景技术

食品安全检测是依据国家有关标准，评价食品质量、判断优劣的主要手段，为食品安全监管工作提供重要的技术支撑。随着国家对食品安全的日益重视，食品安全检测也在逐步发展中。

化学发光免疫分析（CLIA）是将具有高灵敏度的酶催化发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，用以检测抗原的分析技术。化学发光是近十年来在国内外最流行的免疫检测技术，其灵敏度、准确性均要高于传统的酶联免疫分析技术。

三聚氰胺（Melamine）是一种低毒、无味的纯白色单斜棱晶体，形似蛋白粉，属于三嗪类含氮杂环有机化合物，广泛应用于塑料、染料、化肥的生产和纺织行业。由于三聚氰胺分子含氮量高达66%，只要添加到食品或饲料中就可在检测中造成蛋白质含量较高的假象。目前在饲料、牛奶、奶粉、饼干、奶糖等相关产品均发现有三聚氰胺残留现象。动物实验结果表明，三聚氰胺的摄入可能会导致繁殖障碍、膀胱炎、慢性肾炎、肾结石、甚至膀胱癌。因此，食品安全领域需要高精密度与灵敏度的三聚氰胺检测方法。

目前三聚氰胺的检测方法主要采用气相色谱-质谱联用、液相色谱等物理方法，以及胶体金、酶联免疫等生化方法。色谱与质谱方法需要昂贵的仪器与复杂的操作，不适合现场监控与大量样品的筛查。免疫生化方法具有简便、快速的特点，但精密性与重复性存在缺陷。胶体金方法灵敏度低，精密度差，尚不能进行定量测定。酶联免疫方法可以进行定量测定，但精密性、灵敏度仍存在一定的缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测三聚氰胺的化学发光试剂盒，具有简便、快速、灵敏、精密性好的特点。

制备上述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的化学发光方法检测三聚氰胺的试剂盒，采取以下两种可实现的模式中的任何一种：

1）采取三聚氰胺包被载体，酶标记的抗抗体为酶标志物。包被抗原与样本中的抗原竞争结合抗三聚氰胺抗体，酶标志物则结合在抗三聚氰胺抗体上。最后形成的［包被抗原-抗三聚氰胺抗体-酶标记抗抗体］复合物数量与样本中的抗原数量成反比例。

2）采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物。酶标志物与样本中的抗原竞争结合抗三聚氰胺抗体，再被包被抗抗体捕获，最后形成的［包被抗抗体-抗体-酶标记三聚氰胺］复合物数量与样本中的抗原数量成反比例。

所述的抗体可以为单克隆抗体即鼠抗三聚氰胺，也可为多克隆抗体即兔或羊抗三聚氰胺。针对鼠抗体的抗抗体可为兔抗鼠、羊抗鼠，针对兔抗体的抗抗体可为羊抗兔、驴抗兔，针对羊抗体的抗抗体可为驴抗羊。

所述的化学发光试剂盒还包括三聚氰胺校准品、上述酶作用的化学发光底物、浓缩洗涤液。

其中，所述化学发光底物可以为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述1，2-二氧乙烷类衍生物可以为（金刚烷）-1，2-二氧乙烷、3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3”-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）。

其中，所述浓缩洗涤液可以为PH值7.0～8.0的磷酸盐缓冲液，可以含有1%～2%的吐温-20，0.05～0.1%的叠氮化钠。

进一步，根据本发明的制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：

1）以三聚氰胺纯品配制三聚氰胺校准品；

2）以三聚氰胺或抗抗体包被载体；

3）以酶标记抗抗体或三聚氰胺；

4）稀释酶标志物、抗体至应用浓度；

5）分装以及组装试剂盒；

在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述载体为固相载体，可以为微孔板、塑料珠、塑料管或磁珠。优选为微孔板。所述酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

化学发光方法的原理包括免疫竞争反应及发光反应。免疫竞争反应如前所述，样本中的抗原与系统中的抗原竞争结合限量抗体，样本中的抗原数量与最终被固相捕获的酶数量成反相关。发光反应是指酶催化发光底物，发射出单光子信号，可以通过单光子计数器进行检测。

样本中的三聚氰胺的浓度是通过一条参考曲线（或称校准曲线）进行计算的。系列校准品含有不同浓度的三聚氰胺，检测后产生不同的单光子计数。在一定的浓度范围内，浓度与单光子计数之间符合logit-log或四参数曲线模型。根据样品的计数，可以从曲线推算出其浓度。