[发明专利]一种建立双启动子甲醇酵母高效表达重组人金属硫蛋白系统的方法及该蛋白的制备纯化

权利要求书

1.一种建立含双启动子甲醇酵母高效分泌表达基因重组人金属硫蛋白系统的方法及该目的蛋白的制备纯化技术。

2.如权利要求1所述的目的蛋白，其特征在于，所述目的蛋白为人金属硫蛋白(hMT)，包括人金属硫蛋白异构体(hMT-1，hMT-2，hMT-3，hMT-4)及其类似物或片断。

3.如权利要求2所述的人金属硫蛋白异构体，其特征在于，所述的人金属硫蛋白异构体具有如下蛋白质序列：

SEQ ID NO.1，I-型人金属硫蛋白(metallothionein-1，hMT-1)：

1 mdpncscatg gsctctgsck ckeckctsck ksccsccpms cakcaqgcic kgasekcscc61 a

SEQ ID NO 2，II-型人金属硫蛋白(metallothionein-2，hMT-2)：

1 mdpncgcaag dsctcagsck ckeckctsck ksccsccpvg cakcaqgcic kgasdkcscc61 a

SEQ ID NO.3，III-型人金属硫蛋白(metallothionein-3，hMT-3)：

1 mdpetcpcps ggsctcadsc kcegckctsc kksccsccpa ecekcakdcv ckggeaaeae61 aekcsccq

SEQ ID NO 4.IV-型人金属硫蛋白(metallothionein-4，hMT-4)：

1 mdprecvcms ggicmcgdnc kcttcncktc rksccpccpp gcakcargci ckggsdkcsc61 cp。

4.如权利要求1所述的含双启动子甲醇酵母高效分泌表达基因重组人金属硫蛋白系统，其特征在于，制造所述的含双启动子甲醇酵母高效分泌表达基因重组人金属硫蛋白系统包括以下步骤：

1)采用基因工程技术或直接直接DNA化学合成的方法，引入端头符合附图中所示载体质粒pPICZα的一种或两种以上限制性核酸内切酶(XhoI、Cla I、Pst I、EcoR I、Pml I、Sfi I、Bsmb I、Asp718 I、Kpn I、Xho I、Sac II、Not I、Xba I)酶切位点位点插入要求的，且涵盖编码权利要求2、3中所述的一种人金属硫蛋白的氨基酸序列所对应的DNA成熟基因片断和/或含其启动子DNA片断的一条DNA双螺旋 长链(MT基因片断)。

2)使用DNA连接酶，将MT基因片断插入载体质粒pPICZα上相应限制性核酸内切酶酶切位点，使MT基因片断与含一种巴斯德毕赤酵母菌来源的5’调控区(内含启动子元件)的醇氧化酶(AOX1)基因启动子的重组甲醇酵母分泌表达系统整合(嵌合)，构建载体质粒pPICZα-MT。

3)将上一步骤所构建的载体质粒pPICZα-MT上的目的基因片断，包括引导肽表达序列、目的蛋白质编码基因片断、启动子等调控子序列，通过转染(transformation)或同源重组(double crossover recombination)的常规方法，优选同源重组方法，将该含双启动子的外源基因引入相关宿主酵母细胞，构建了含双启动子甲醇酵母高效分泌表达基因重组人金属硫蛋白系统。

5.如权利要求4所述的载体质粒pPICZα-MT及含双启动子甲醇酵母高效分泌表达基因重组人金属硫蛋白系统，其特征在于，含有基因表达结构式：5’--S—T—3’，式中：S为引导肽表达序列，其编码氨基酸序列为EAEAEFR，或EAEFR，或EFR，或酿酒酵母来源的α交配因子基因引导肽序列(即AMF prepro序列，其序列为一种编码85个氨基酸的基因片段，内含有酵母菌KEX-2蛋白酶加工位点Lys-Arg两个密码子)；T为编码权利要求2、3中所述的一种人金属硫蛋白的氨基酸序列所对应的DNA成熟基因片断，该片断含或不含金属应答元件(MRE)和/或类金属应答元件(MLS，MRE-like sequence)。