[发明专利]一种高黄酮含量杭白菊的培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种杭白菊的培育方法，尤其是提高黄酮含量的杭白菊的培育方法。

背景技术

杭白菊为菊科植物菊的干燥头状花序，栽培历史悠久，据有关史料记载，迄今至少已有360余年之久，系“浙八味”地道药材之一。杭白菊含有木犀草素-7-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-β-D-葡萄糖苷、金合欢素-7-β-D-葡萄糖苷等多种黄酮类有效成分，抗氧化作用优良，具有“清热散风、平肝明目”之功效。早期研究发现表明，杭白菊具有解热、抑菌、抗流感病毒、抗心血管、抗炎等作用，近年来国内外有研究显示杭白菊具有抗氧化、抗肿瘤、抗爱滋等作用。目前，加工生产企业主要提取分离菊花总黄酮，因此，选育高黄酮含量的杭白菊新品种成为育种的主要方向。

发明内容

正是在上述背景下，本发明的目的是提出一种高黄酮含量杭白菊的培育方法，以获得高黄酮含量杭白菊，进行类黄酮的开发，用于食品和医药工业。

本发明的高黄酮含量杭白菊的培育方法，包括以下步骤：

1）取杭白菊的子叶为外植体，接种至诱导培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；

 2）将诱导形成3周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期；

 3）将成倍增殖的愈伤组织，在25±1℃避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；

4）将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25±1℃避光的黑暗条件下共培养2天；

5）将上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25±1℃避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继１次；

6）取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指目的基因查耳酮合酶基因CHS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因查耳酮合酶基因CHS片段长960bp；

7）取入选的转基因植株，田间种植测定花瓣中总黄酮含量，选留总黄酮含量高于3%的转基因植株；

8）继续种植步骤7）筛选的转基因株系，评价黄酮含量的表达稳定性，繁殖总黄酮含量稳定高于3%的优良株系，为培育的高黄酮含量杭白菊。

本发明中，所说的诱导培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.7。

本发明中，所说的继代培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.7。

本发明中，所说的共培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、乙酰丁香酮1mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.7。

本发明中，所说的筛选培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、潮霉素25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.7。

本发明中，所说的分化培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA4mg/L、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.7。