[发明专利]一种高黄酮含量马棘的培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种马棘的培育方法，尤其是提高黄酮含量的马棘的培育方法。 

背景技术

我国新农村建设的首要任务是不断提高农民收入，发展效益农业是有效途径之一。因此，在继续重视高产、优质和抗病农作物传统育种的同时，发展以功能型为特征的农作物成为育种新方向，有助于提高农产品的附加值，实现效益农业与农民增收有机结合，“以用促种”保障农村经济持续稳定长效机制的形成。 

马棘(Indigofera pseudotinctoria Mats)系豆科木蓝属多年生小灌木，具有耐热、耐旱、耐瘠、适应性广的特点，适合绿化荒山、护坡固坎、保持水土，也是牛和羊等草食性动物的优质青饲料。我国为多山、多丘陵的国家，马棘尤其适宜种植于广大贫瘠干旱的堤坡缓地，这对山区生态经济的可持续发展具有重要意义。 

生物总黄酮系一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分具有如下重要的生理功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。 

黄酮醇合成酶基因FLS是黄酮生物合成中关键调控酶，可以二氢黄酮醇为底物，高效调控合成槲皮素、山萘酚、杨梅素等黄酮醇。 

发明内容

正是在上述背景下，本发明的目的是提出一种高黄酮含量马棘的培育方法，以获得高黄酮含量马棘，进行类黄酮的开发，用于食品、医药、饲料和化工等领域。 

本发明的高黄酮含量马棘的培育方法，包括以下步骤： 

1）取马棘的成熟种子为外植体，接种至诱导培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；

 2）将诱导形成3周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期；

 3）将成倍增殖的愈伤组织，在25±1℃避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；

4）将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25±1℃避光的黑暗条件下共培养2天；

5）将上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25±1℃避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继１次；

6）取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指目的基因黄酮醇合成酶基因FLS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因黄酮醇合成酶基因FLS片段长821bp；

7）取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，测定叶片内黄酮含量，选留黄酮含量高于3%的转基因植株；

8）继续种植步骤7）筛选的转基因株系，评价黄酮含量的表达稳定性，繁殖黄酮含量稳定高于3%的优良株系，为培育的高黄酮含量马棘。

本发明中，所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2,4-D1.5mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。 

本发明中，所说的继代培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。 

本发明中，所说的共培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg、乙酰丁香酮2mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。 

本发明中，所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg、潮霉素25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。 

本发明中，所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BA1.0mg、NAA1mg、KT1.5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。