[发明专利]一种用于制备转基因小鼠的精子处理方法

权利要求书

1.一种用于制备转基因小鼠的精子处理方法，其特征在于将小鼠附睾精子于5％CO₂培养箱37℃孵育8～10分钟，然后将含有目的基因的线性DNA片段与精子混合，2℃～5℃冰浴25～30分钟，40～45℃热休克1～3分钟，2℃～5℃冰浴3～5分钟，5％CO₂培养箱37℃孵育50～70分钟获能。

2.根据权利要求1所述的精子处理方法，其特征在于将小鼠附睾精子于5％CO₂培养箱37℃孵育10分钟，然后将含有目的基因的线性DNA片段与精子混合，4℃冰浴30分钟，42℃热休克1分钟，4℃冰浴3分钟，5％CO₂培养箱37℃孵育60分钟获能。

3.根据权利要求1或2所述的精子处理方法，其特征在于所述的含有目的基因的线性DNA片段是将目的基因插入表达载体后经双酶切得到的包括特异性启动子、目的基因在内的线性DNA片段。

4.根据权利要求3所述的精子处理方法，其特征在于所述的含有目的基因的线性DNA片段是将目的基因插入重组表达载体pTH-CB后经Pvul、Smal双酶切得到的包括特异性启动子、目的基因在内的线性DNA片段。

5.根据权利要求4所述的精子处理方法，其特征在于所述的重组表达载体pTH-CB是通过如下方法获得：克隆小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列和钙结合蛋白D-28K基因cDNA序列，用BamHI、HindIII内切酶双酶切小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列和质粒pcDAN3.1(+)，回收连接酶切序列，使得小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列替换pcDAN3.1(+)中的CMV启动子序列；在此基础上，用HindIII、NotI内切酶双酶切上述重组质粒和钙结合蛋白D-28K基因cDNA序列，将钙结合蛋白D-28K基因cDNA序列插入上述重组质粒的多克隆位点即得所述的重组表达载体pTH-CB。