[发明专利]犬钩虫抗凝肽及其制备和应用

说明书

本申请为申请号200710079673.0、申请日为2007年3月5日、发明名称“犬钩虫抗凝肽及其制备和应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及医药及生物技术领域。具体的说，本发明涉及从犬钩虫中分离到的犬钩虫抗凝肽新基因及其编码的蛋白质。本发明还涉及这些新的犬钩虫抗凝肽的制备和应用。

技术背景

血栓性疾病是一种常见病，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞。每年每一千人中有1～3人发生不同形式的血栓性疾病。在当前人类疾病中，血栓栓塞性疾病已成为危害人类健康的主要因素，由血栓栓塞所致的心肌梗死、脑梗死、肺梗死等其死亡总数为各种病因之首。如何防治该类疾病是目前临床与医药科学研究的热点，尽管有肝素、口服香豆素、链激酶和尿激酶等药物多年应用的历史，但这些药品的出血、血小板减少等副作用限制了其应用，有的用药时还需要特别监测。因此开发出疗效好、毒副作用低的血栓性疾病防治药物倍受科研人员的关注。目前临床上治疗血栓性疾病的药物主要分为抗血小板类药物、抗凝血药物和溶血栓药物三大类。其中，抗凝血药是一类干扰凝血因子，是阻止血液凝固的药物，主要用于血栓栓塞性疾病的预防与治疗，特别使用于栓塞性疾病的预防。肝素类(如低分子量肝素LMWH)药物是目前市场上占主要地位的抗凝血药物，如世界上每年有6000万病人接受肝素治疗以防治急性冠脉综合症等各种血栓性疾病。

钩虫寄生于人或动物宿主肠道，引起宿主慢性失血，从而导致宿主贫血。其中原因之一是钩虫能分泌抗凝物质，使宿主被钩虫咬附伤口不易凝血，血液并迅速经钩虫消化道排出。早在20世纪初，就有学者证实了犬钩虫(Ancylostoma caninum)提取物具有抗凝作用，但直到1993年才从犬钩虫中分离出首个抗凝血肽，其后并证实该抗凝血肽可显著延长凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶原激酶时间(aPTT)。该抗凝肽被命名为犬钩虫抗凝肽(Ancylostoma caninum anticoagulant peptide，AcAP)，也称线虫抗凝血肽(nematode anticoagulant peptide，NAP)或线虫抗凝血蛋白(nematode anticoagulant protein，NAP)。1996年，Stassens等根据测得抗凝肽部分氨基酸序列设计核酸探针，从犬钩虫cDNA文库中筛选到三个抗凝血肽基因，它们在Pichia pastoris中的表达产物rAcAP5(rNAP5)、rAcAP6(rNAP6)和rAcAPc2(rNAPc2)均显著延长PT，并成剂量依赖关系。其中，延长PT活性以rAcAPc2(rNAPc2)为最好，延长aPTT活性以rAcAP5(rNAP5)为最好，rAcAP6(rNAP6)抗凝活性略弱于rAcAP5(rNAP5)(Stanssens P，P W Bergum，Y Gansemans et al.Anticoagulant repertoire of the hookworm Ancylostoma caninum.Proc Natl Acad Sci USA.1996；93：2149～2154.)。2002年，Stassens等报道了采用cDNA末端快速扩增技术，从锡兰钩虫(Ancylostoma ceylanicum)中得到了抗凝血肽AceAP1基因，并在大肠杆菌中表达获得了rAceAP1，其抗凝活性远较rAcAP5(rNAP5)、rAcAP6(rNAP6)和rAcAPc2(rNAPc2)低(Harssion，L.M.，Nerlinger，r.D.Bungiro et al.Molecular characterization of Ancylostoma inhibitors of coagulation factor Xa.Hookworm anticoagulant activity in vitro predicts parasite bloodfeeding in vivo[J].J.Biol.Chem，2002；277(8)：6223-29)。2004年，Juliusz等人报道了根据AcAPc2信号肽氨基酸保守序列设计引物，采用RT-PCR从犬钩虫中获得两种同源多肽，并分别命名为AcAPc3、AcAPc4，重组表达产物rAcAPc3、rAcAPc4抗凝活性明显不及rAcAPc2(rNAPc2)(Mieszczanek J，Harrison L M，Vlasuk G P and Cappello M.Anticoagulant peptides from Ancylostoma caninum are immunologically distinct and localize to separate structures within the adult hookworm.Mol Biochem Parasitol.2004；133(2)，319-323)。最近，本发明人也公开了犬钩虫抗凝肽AcaNAP7基因序列(GenBank录入号：DQ435781)、AcaNAP8(GenBank录入号：DQ435782)，并实验证实它们的重组表达产物具有很好抗凝活性(申请者待发表的结果但是还未公开)。钩虫抗凝肽及其重组产物具有明确的抗凝血作用，其抗凝作用机制已引起人们的重视并被探讨应用于临床实践。rAcAPc2(rNAPc2)和rAcAP5(rNAP5)的临床或临床前试验表明它们具有广阔的应用前景，是目前倍受医药专家关注的正在开发的抗凝抗血栓药物。