[发明专利]新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种在流行病学监控中用于新布尼亚病毒感染诊断依据的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

2007年，河南省信阳、南阳地区发现了多例不明原因发热、严重消化道出血症状，白细胞、血小板减少，并伴出血倾向的病人。河南省疾病预防控制中心对此开展了专项调查，根据临床特点建立疾病定义，扩大搜索范围，建立症状监测报告系统，命名为发热伴血小板减少综合征，多种已知病原体检测阴性，仅极少部分病例人嗜粒细胞无形体核酸、血清学检测阳性，随后湖北、山东、安徽、江苏、辽宁等省也发现了类似病例。

2010年河南省新发传染病创新科研团队在发热伴血小板减少综合征病例急性期血清标本中分离到一种未知病原体，完成了新病毒全基因组测序，结合电子显微镜形态学观察、流行病学和临床特征，确定为布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，并命名为新布尼亚病毒。新布尼亚病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，呈球形，直径80～100 nm，有包膜，表面有棘突，基因组含三个单股负链RNA片段（L、M和S)。可以经接触血液、虫媒等途径传播，对人体致病严重，潜伏期为7～9天，主要临床表现为突然起病、发热、乏力、纳差、恶心、呕吐等；部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等症状；体格检查常有颈部及腹股沟等浅表淋巴结肿大伴压痛、上腹部压痛及相对缓脉；部分病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血（DIC）等多脏器功能衰竭死亡，病死率较高。该病严重影响了人民群众身体健康，给民众造成了巨大的经济损失和精神负担。因此，针对感染新布尼亚病毒导致的发热伴血小板减少综合征病例提供一种简便、快速、灵敏、特异性高的检测试剂成为目前临床诊断该类病人的迫切需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒可以快速、简便、敏感、特异性的检测发热伴血小板减少综合征病人急性期血清中新布尼亚病毒的存在，为疾病的诊断和流行病学调查提供参考依据。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括PCR反应酶、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和DEPC H₂O，所述PCR反应液包括特异性引物和荧光探针，上游引物为：5’- GAARTCCTCAAGCTCAGTCAAATTG -3’，下游引物为：5’-GCAAAGGAGTGATCATGTCIGAGT -3’，荧光探针为：5’-CTGCTGCTCACCAAACTCCACIGCA -3’；阳性质控品模板的核苷酸序列为：TAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGGGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACTTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATAAAGAGTAAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTCGTGGCTTCAGATACCCCTGCAGTTGGAATCAGGGACCCGAAGGCCATGCACATCATCTCAGGGGGATAATTCTCGACCTTCAGGTTCATGACGGCTGGCCCCACAGGGAGATACTCCTTTAAGGCTGCTGCTGCAGCACATGTCCAAGTGGGGAGGCTCTGCGCTACCCTTACTGGGGTGATTGAGAGCCTGGTCTCTGCCCTCTCAACCAGCCCATATTTCTCCTGGAGTGCCATCAACCTCTTAGACCCTGAGTTTGACATCTTCCCTGATGCCTTGACGATCTTATTGCCTCGAGTCAGGGCAAAGACAATGATGAACTTAGTATCCTTCACCCAGTCATCTCCACCTGTCTCCTTCAGCTTCTTGATGATCAAAGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCTAGCTCTCTCGCGAAATCCTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCTGCTCACCAAACTCCACTGCAATTCTGGACCACTCTGACATGATCACTCCTTTGCGTCTTTCCTTTTTTGGGGGTTT。

所述阳性质控品模板是含有插入新布尼亚病毒特异性核酸序列的PUCM-T质粒载体，该载体可在大肠杆菌JM109中增殖。