[发明专利]一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法

权利要求书

1.一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法，其特征在于按步骤实现：

A、限制性内切酶消化：细胞中提取的gDNA经过MseI和NdeI两种限制性内切酶酶切摩尔比1：1；

B、Linker寡核苷酸连接： Linker通过互补配对连接到各个gDNA片断的5’-TA-3’； 其中linker为11+2-mer oligo 和42-mer oligo ；11+2-mer oligo的序列为5’-TAC CCG CGT CCG C-3’；42-mer oligo的序列为5’-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGG TGC GGA CGC GGG-3；

C、Telorette片断的连接： telorette被连接到端粒的5’端；其中Telorette序列如下，可任选择其中一个序列：

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3’；

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3’；

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’；

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’；

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’；

 5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3’；

D、PCR扩增端粒片段，其中引物为5’-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA-3’，5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TC-3’-标记物。

2.根据权利要求1所述的一种用改良STELA法测细胞中最短端粒长度的方法，其特征在于按步骤实现：

A、提取gDNA；

B、取步骤A中的gDNA 1 ug，加入MseI/NdeI摩尔比1：1双酶切，同时加入1x NEBuffer2和1x BSA，37 ℃反应过夜；

C、 10 ng消化后的gDNA片断于65 ℃加入50 uM 42-mer oligo和50 uM 11+2-mer oligo，反应体积为7 ul；之后将反应温度由65 ℃于1 h内降至16 ℃；加入20 U T4 DNA连接酶，1x NEBuffer2和1x ATP，于16 ℃反应过夜；

其中11+2-mer oligo的序列为5’-TAC CCG CGT CCG C-3’；

42-mer oligo的序列为5’-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGG TGC GGA CGC GGG-3；

D、    在步骤（C）中反应体系中补加20 U T4 DNA连接酶和10^-3 uM Telorette，并补充相应的1x NEBuffer2和1x ATP，使反应体积达到25 ul，35 ℃反应过夜，然后于65 ℃反应20 min，灭活T4 DNA连接酶，获得DNA；其中Telorette序列如下，可任选择其中一个序列：

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3’；

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3’；

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’；

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’；

5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’；

 5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3’；

E、PCR反应体积为12 ul，模板DNA 50 pg（步骤（3）获得），1x FailSafe PCR PreMix H，0.1 uM teltail引物和Adaptor引物，1.25 U FailSafe enzyme；PCR条件为：

 adapter序列为：5’-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA-3’；

Teltail序列为：5’-TGC TCC GTG CAT CTG GCA TC-3’-标记物；

F、PCR结束后，以琼脂糖电泳检测扩增片段。