[发明专利]一种新生大鼠海马神经元原代培养的培养液及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新生大鼠海马神经元原代培养液及其制备方法和应用。 

背景技术

神经元是神经系统结构和功能的基本单位，也是研究神经系统生理、病理机制及各种神经递质功能的良好材料。海马组织中神经元数量和分布较为集中，海马神经元体外培养是研究神经系统结构、功能以及病理、生理变化的重要手段之一。现有的海马神经元培养液中基本都是在DMEM、F12培养基添加血清，培养海马神经元。血清增加了胶质细胞等非神经元增殖速度，影响了海马神经元的纯度，对神经细胞有不同程度的毒性，且由于血清中成分复杂，对实验产生一定的影响或干扰。神经元培养的一个重要问题是保证神经元的纯度与活性。 

中国专利CN1966674A公开了一种蜘蛛中枢神经细胞培养液，该发明所采用的培养液添加了200ml小牛血清；中国专利CN1171991C公开了“人神经干细胞的培养方法”，该发明培养液由DMEM和F12以1∶1混合而成的基础培养液，添加胰岛素、L-谷氨酰胺、盐酸丁二胺、硒化钠、人转铁蛋白、氢化可的松、黄体酮，另外添加5-20％新鲜血清；因此，以上神经培养液的配方和方法同样存在不能有效减少了胶质细胞的生长，保证神经元纯度的问题。培养液中即使添加了阿糖胞苷等抑制胶质细胞分裂的药物能提高神经细胞的纯度，但是，阿糖胞苷的加入对神经细胞生长也有一定的抑制作用，严重影响所培养的神经元活性。 

尽管无血清培养出现，提高了神经元培养的纯度，减少了胶质细胞的生长，但是所培养的海马神经元仍然具有存活率低、细胞生长缓慢和突触形成少等缺点，不能满足对细胞进一步实验的要求。目前无血清培养液的添加物都含有Invitrogen(GIBCO)公司研发的神经元培养液B27或(和)N2，其主要成分为多种维生素和微量元素。尽管提高了神经细胞培养的纯度，有效减少了胶质细胞的生长，但是仍然存在不能为海马神经元培养提供足够的能量，在缺氧环境下尤为明显，更容易导致致死性损害，影响了海马神经元的生长状态，从而造成细胞存活率低、细胞生长缓慢和突触形成少等问题。通过增加葡萄糖剂量的方法，结果会更糟糕，葡萄糖作为能源物质在无氧酵解产生大量乳酸堆积，也会降低培养液的pH值， 增加渗透压，损害神经细胞，造成培养基中神经细胞生长抑制，同时也增加了神经细胞污染的机会。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有纯度高、生长状态好的海马神经元的培养液及其制备方法，并提供了利用这种培养液培养海马神经元的方法。 

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是，一种海马神经元培养液，该培养液为在基础培养液中加入1、6二磷酸果糖、果糖和营养添加剂；每升基础培养液中加入1-10mmol的1、6二磷酸果糖和2-20mmol的果糖，其中所述基础培养液为Neurobasal Medium。 

所述1、6二磷酸果糖与果糖质量浓度比为1∶2。每升基础培养液中加入如下组分的营养添加剂：10-20μg碱性成纤维细胞生长因子，6-15mg ATP，30-50U辅酶A，0.1-1g两性霉素B，5-50mg胰岛素，0.42-0.83mg硫酸亚铁，5-50mg人转铁蛋白和20-60mg维生素混合液。维生素混合液为生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、肌醇、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12和烟酰胺的混合物。其中，本发明所述的商品化基础培养液Neurobasal Medium(GIBCO公司)。之后采用0.22μm的滤膜过滤除菌。配置好的培养液置于4℃储存。 

本发明的培养液中1，6-二磷酸果糖是能在分子水平上调节细胞代谢中若干酶活性，恢复和改善细胞代谢，减轻细胞损伤，能促进血液循环，增加ATP合成。果糖作为体外培养的能量成分明显优于葡萄糖，果糖酵解与葡萄糖酵解的主要区别在于在果糖酵解过程中，果糖氧化磷酸化为F-1-P(1-磷酸果糖)——糖酵解前体物质，能在缺氧状态下提供ATP，维持细胞膜的离子泵，所以能有效的保护细胞膜的完整性和维持细胞活性的功能。而葡萄糖代谢过程中却不能产生F-1-P。本发明添加1，6-二磷酸果糖和果糖的混合物有较好的效果，1，6-二磷酸果糖和果糖有显著的协同作用，可以显著增加增加海马神经元的活力，尤其在缺氧状态下照常提供ATP细胞，保证神经元的纯度与活性。 

所述本发明的培养液中营养添加剂包括碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素、硫酸亚铁、人转铁蛋白、ATP、辅酶A、两性霉素B和维生素混合液。