[发明专利]一种新型水溶性巯基荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种新型水溶性巯基荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

巯基(-SH)是细胞中化学活性最高的基团之一。在蛋白质中，巯基部分是与酶活性相关的反应活性最高的官能团。细胞中的巯基化合物，尤其是谷胱甘肽，做为生物体内一种重要的抗氧化剂，它能够清除掉人体内的自由基，清洁和净化人体内环境污染，从而增进了人的身心健康。特别是还原型谷胱甘肽(GSH)本身易受某些物质氧化，所以它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能。随着巯基官能团在生物体内的重要生理作用逐渐被认识，鉴别和定量测定生物巯基化合物的方法日益受到关注。传统的检测方法有硝普盐法、碘量法、电流分析法、分光光度法、比色法等，但这些方法存在灵敏度低(毫摩尔级以上才能检测)、操作复杂、选择性差等缺点，不能适应有些生物样品中巯基化合物的测定，因此需要合成一些高灵敏度的分析检测试剂。

荧光测定法由于其成本低，可重复性好，测定灵敏，选择性高，并且能够实现可视化观测，是一种非常好的测定手段。因此，新型的巯基荧光检测试剂成为研究的焦点。巯基荧光探针由于检测灵敏度高，并可作为生物结构研究指示系统，因而被广泛应用到研究蛋白质结构和微环境性质、微量检测胆碱酶或谷胱甘肽S-转移酶、组织化学染色、抗原-抗体反映的监测和定位、疾病的诊断、HPLC分析巯基化合物等领域。

已报道的巯基荧光探针有芳基卤化物、丹磺酰氮丙啶类等，它们具有较好的灵敏度，对巯基的检测限一般在纳摩尔(nmol)左右，但这些探针自身都有较强的荧光，用于活细胞成像时会造成较低的信噪比；还有一类如苯并呋喃磺酰卤，虽然自身荧光较弱，但需要在碱性条件及高于室温下与巯基衍生，也无法应用于活细胞成像。最常用来衍生巯基的试剂是乙酰卤衍生物，主要是碘乙酰胺衍生物，它和巯基反应快，在室温和生理pH下即可进行，但产物容易失去荧光团，并且自身对光不稳定。这些现存的巯基荧光探针均不能很好的满足生物荧光检测和荧光成像的要求。

我们通过研究发现含2-(2′-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)结构的小分子荧光化合物是一类具有激发态质子转移(ESIPT)特性的荧光化合物，具有斯托克斯(Stokes)位移大，荧光量子收率高，能与过渡金属形成比较稳定的配合物等优点，可作为新型功能荧光分子探针的特色荧光团。我们以2-(2′-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)类化合物作为配体，设计合成了新的二价铜离子配合物，开展了过渡金属配合物类巯基荧光探针的初步研究。实验结果表明，HPBI类荧光化合物与顺磁性的二价铜配合之后，发生了消光作用。这是由于激发态质子转移(ESIPT)机理，基于HPBI结构的功能荧光探针分子可以在光激发条件下形成烯醇式和酮式互变异构体产生较强的荧光。随着铜离子的加入，形成了新的复合物使得ESIPT过程受阻，探针分子荧光消失。还原型谷胱甘肽(GSH)加入后与二价铜离子形成了新的复合物，使探针化合物游离出来，ESIPT过程得以恢复，并产生荧光。基于此原理我们可以发展一种快速、简便的用于检测GSH的方法。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种新型水溶性巯基荧光探针及其制备方法，该荧光探针生物相容性好，可用于活细胞中GSH成像测定，植入生物体内测定真实的巯基化合物浓度变化，有利于相关疾病的诊断，并提供一种快速、简便的用于检测还原型谷胱甘肽(GSH)的方法。

本发明的技术方案：

一种新型水溶性巯基荧光探针，化合物名称为2-[5′-(三甲基季铵盐基)-乙酰胺基-2′-羟基苯基]苯并咪唑(TMACA-HPBI)，其化学分子式为C₁₈H₂₁N₄O₂Cl，该化合物以2-(2′-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)结构作为荧光发色团，以三甲基氯化铵作为亲水性基团提高分子的水溶性，熔点高于300℃，溶于水后在波长为365nm的紫外灯照射下发出蓝色荧光，该荧光探针的分子结构式为：

一种所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法，步骤如下：

1)将苯胺溶于水中得到苯胺水溶液，加入浓盐酸使苯胺完全溶解，冰浴冷却到0-4℃，得到苯胺盐酸盐溶液，将亚硝酸钠溶于水中得到亚硝酸钠水溶液，冰浴冷却到0-4℃后以每秒钟1-2滴的速度滴加到上述苯胺盐酸盐溶液中，制得苯胺重氮盐溶液；