[发明专利]利用复合酶制备黑色素及其前体物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵领域和酶固定化领域，具体地说，涉及一种利用复合酶制备黑色素及其前体物质的方法。

背景技术

黑色素(melanin)是广泛存在于动、植物和微生物中的一类重要的天然色素，具有复杂结构，一般为非均质的类多酚聚合体。动物体组织中的黑色素并不是以单一的黑色素形式存在，而是真黑素和脱黑素两种类型的混合色素，所以表现出了皮肤及被毛的多种色泽。黑色素在生物体内是通过酪氨酸酶，互变异构酶等复合酶，进行一系列酶促反应，将酪氨酸及半胱氨酸等氧化成真黑素和脱黑素混合而成的天然黑色素(图1和2)。黑色素的前体物质包括多巴色素、5，6-二羟基吲哚、5，6-二羟基吲哚-2-羧酸等，具有抗氧化、抗辐射等功能，并且可以用于制备新型高效的天然黑色素染发剂。

现常用的永久性染发剂多为氧化性染发剂，常采用的染料是对苯二胺，对氨基苯酚，邻氨基苯酚，对甲苯二胺和邻甲苯二胺，对人体具有很大的潜在危害。而现在研制开发的天然染发剂多来源于植物提取物。目前制取黑色素有两种方法，一是从粮食如黑豆、黑芝麻、高粱等种皮经酸洗法制取的，产量小，成本高；二是发酵黑酵母从酵母菌体分离制取的，菌种分离困难，设备复杂，投资较大。

CN1420144A中从植物中提取酪氨酸氧化酶，以酪氨酸一元酚衍生物为底物，控制酶促合成反应条件合成黑色素，其使用的酶比较单一，影响酶促效率，且无法反复使用，另外，从植物中提取酪氨酸酶，成本较高。

使用微生物生产黑色素，尤其是利用从产黑色素的芽孢杆菌发酵液中提取的复合酶制备天然黑色素，从而制备染发剂尚未见报道。

发明内容

本发明旨在克服现有制备黑色素工艺的不足，提供一种利用复合酶制备黑色素的新方法。

为了实现本发明目的，本发明使用一种利用复合酶制备黑色素及其前体物质的方法，其是利用从产黑色素的芽孢杆菌发酵液中提取的含有酪氨酸酶的复合酶，以酪氨酸和/或其衍生物为底物，通过酶促反应生成黑色素及其前体物质。

前述方法中，所述复合酶中还含有互变异构酶等。

前述方法中使用的底物包括：(1)D型或L型酪氨酸；(2)D型或L型多巴(3-(3，4-二羟基苯基)丙氨酸)；(3)多巴胺(Dopamine；3，4-二羟基苯基乙胺)；其中优选使用L型酪氨酸。

前述方法中，为了进一步促进含酪氨酸酶、互变异构酶等的复合酶的转化能力，还包括向酶及底物的反应体系中加入蛋白酶的步骤。优选所述蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等中的一种或多种。

前述方法中，从芽孢杆菌发酵液中提取复合酶所采用的方法为超滤或离心等。

前述方法中，还包括对复合酶进行固定化的步骤。所述固定化是使复合酶结合到载体上，以便下一步对酪氨酸和/或其衍生物进行酶促转化。所述载体为海藻酸钠、聚乙烯醇、硅藻土、分子筛等中的一种或多种。

前述方法中，所述产黑色素的芽孢杆菌从人类头发中筛选得到，并通过发酵法复筛，确定目标菌株为芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)PMR02，已于2011年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5640。

芽孢杆菌PMR02是以酪氨酸为底物，最终合成黑色素，发酵过程中，如不添加酪氨酸，则不会有黑色素生成，该菌产生黑色素的紫外可见光谱结果显示在210nm左右具有紫外吸收峰，红外光谱具有吲哚结构吸收峰和电子自旋波谱显示该黑色素含有大量的自由基，认为该菌产生的黑色素为吲哚型黑色素，与人体毛发黑色素结构一致。

本发明通过提取芽孢杆菌PMR02菌种发酵液中含酪氨酸酶、互变异构酶等的复合酶，以L-酪氨酸和/或其衍生物为底物，通过固定化酶的方法制备得到包括多巴色素、5，6-二羟基吲哚、吲哚-5，6醌、5，6-二羟基吲哚-2羧酸等系列黑色素前体物质。

种子培养基：PDA培养基或牛肉膏蛋白胨培养基，接入芽孢杆菌PMR02菌种，置于恒温摇床上，转速为100～200r/min，于34℃～42℃培养6～24h，至630nm下OD值0.8时接种入发酵培养基。