[发明专利]克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一酶联免疫法及专用试剂盒与试剂盒的检测法

说明书

技术领域

本发明涉及β兴奋剂检测技术领域，具体来说是一种克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇一次性检测的酶联免疫法及其专用检测试剂盒与试剂盒的检测方法。 

背景技术

随着人们的生活水平的不断提高，人们开始对自己的身体健康也越来越关注，在日常生活中，人们会经常烹食肉类食品，来增强自身的免疫性和补充营养，但在烹食肉类食品时，人们往往会担心一个问题——“肉类食品中是否含有β兴奋剂(瘦肉精)”，β兴奋剂是一种能够促进瘦肉生长的药物添加剂，例如盐酸克伦特罗即盐酸盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。其能使猪提高生长速度，增加瘦肉率，且可使猪毛色红润光亮，卖相好；屠宰后，肉色鲜红，脂肪层极薄，往往是皮贴着瘦肉，瘦肉丰满，但对人体会产生副作用，轻则导致心律不整，严重一点就会导致心脏病。 

目前检测β兴奋剂主要有方法有色谱技术和免疫分析技术等方法。 

色谱法包括高效液相色谱法和气质联用色谱法。高效液相色谱(HPLC)法的优点是检测精密度高，假阳性率低，但存在样品处理时间长、检测过程繁琐、仪器昂贵、难于操作等缺点，在实际应用中受到一定的限制。而气质联用法(GC-MS)检测前需要对分子上的羟基、氨基等极性基团衍生化，难以作为常规方法应用，不能进行现场检测。 

免疫分析技术包括放射性免疫分析技术、金标免疫分析和酶免疫分析技术技术等。放射性免疫分析技术具有特异性强、灵敏度高、准确、快速、操作简便、易于标准化等优点，但其所用仪器昂贵，且使用的放射性同位素存在辐射和污染，其废弃物不易处理，限制了此种方法的广泛应用；金标免疫分析技术能对大量样品进行筛选，但其假阳性率较高，检测灵敏度欠缺，稳定性不足，无法提供准确的结果。 

发明内容

本发明的目的是提供一种克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇一次性检测的酶联免疫法及 其专用检测试剂盒与试剂盒的检测方法，以克服目前现有技术存在的上述不足，灵敏度高、稳定性好，准确可靠，大大简化操作步骤和反应时间，且降低成本，适合大量样品的筛查。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 

一种克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇一次性检测的酶联免疫检测方法，其特征在于：在酶标板上预包被上单克隆抗体，待检测样品中的克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，还有酶标抗原一起竞争结合包被的单克隆抗体后，用显色剂显色，待检测样品中的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇含量与待检测样品的百分吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出待检测样品中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺含量，所述标准曲线是以克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品浓度百分吸光度值为纵坐标，以克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品浓度的对数值为横坐标绘制而成，所述预包被的单克隆抗体能同时对克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇发生交叉反应，所述百分吸光度值按下式计算： 

其中B是标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；B0是第一个标准溶液的平均吸光度值。 

所述酶标抗原是通过辣根过氧化物酶HRP标记克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺而得到，所述待检测样品为待检猪尿、猪肝或血液血清的待检测样品，猪尿待检测样品若是清亮尿样，就直接测定，如尿样浑浊须过滤或离心直至清亮，暂不使用尿样待检测样品应冷冻保存，避免反复冻融采取，所述酶标抗原是通过辣根过氧化物酶HRP标记克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺而得到，所述血液血清待检测样品处理方法为：取血清，加入酶标记物稀释液稀释，震荡混合均匀即可。 

一种专用于前述检测方法的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：1)权利要求1所述的预包被上单克隆抗体的酶标板；2)权利要求1所述的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一标准品溶液；3)浓缩酶标记物；4)酶标记物稀释液；5)显色液；6)浓缩洗液；7)终止液；所述酶标记物是在低pH条件下直接氧化辣根过氧化物酶HRP，辣根过氧化物酶HRP经NaIO₄氧化后形成的醛化酶与克伦特罗、沙丁 胺醇、莱克多巴胺三种物质的抗原分子的氨基相连，形成斯夫氏碱，进一步用NaBH₄还原生成稳定物质。 

所述预包被的单克隆抗体由合成好的完全抗原免疫小鼠，经骨髓细胞融合，培养，筛选出分泌抗体的杂交细胞株，杂交细胞株进行克隆化得到。 

所述检测试剂盒的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇交叉反应率分别为：100％、80％、80％，所述检测试剂盒检测尿液和血清的回收率都为60～140％。