[发明专利]依非韦伦肝细胞毒性分子标志物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及依非韦伦(efavirenz，EFV)肝细胞毒性分子标志物及其应用，具体涉及D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测肝细胞毒性分子标志物中的用途。

背景技术

艾滋病全称为“获得性免疫缺陷综合征”(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)。截至2010年底，我国确诊艾滋病病毒感染者和病人约37万，其中2010年新发艾滋病人数15982例，给我国政治和经济造成极大的影响。高效联合抗逆转录病毒治疗(Highly Active Antiretroviral Therapy，HAART)是目前治疗艾滋病最主要的方案，是改善患者预后，提高患者生存质量的主要途径。目前有如下5类药物可供临床选择：核苷类反转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂及融合抑制剂。其中NNRTI类药物有3个：依非韦伦(efavirenz，EFV)、奈韦拉平(nevirapine，NVP)和地拉韦啶(delavirdine)。依非韦伦EFV为国际艾滋病治疗指导方针推荐的非核苷类(NNRTI)首选药物，联合2个核苷类(NRTI)药物可作为抗HIV感染的一线治疗方案。但是EFV耐药屏障低[1]，HIV-1反转录酶(RT)单一位点突变株对依非韦伦耐药，为此临床和科研工作者进行大量的病毒耐药基因检测工作；此外，EFV有较严重的肝损，皮肤过敏反应和神经系统毒性^1，2。队列研究¹显示：EFV治疗导致8.0％肝损伤(312个入选患者)，NVP治疗肝损伤的比率为15.6％(256例入选)。结核³、病毒性肝炎及联合应用蛋白酶抑制剂(PI)会增加肝损伤的比率。

人体CYP2B6代谢酶的多态性是EFV肝毒性的一个重要原因。Katsounas A等⁴对576艾滋病患者进行依非韦伦EFV血药浓度检测，发现EFV的浓度在1000-4000ng/mL之间能较好的控制HIV，超过4000ng/mL容易引起肝毒性。对于基因型为CYP2B6*6/6*或者*6/26*的患者均出现516位的G变为T(516G-＞T)，EFV的代谢减慢，导致血药浓度高达6000ng/mL，出现神经毒性和肝毒性。当药物剂量被减少到400或200mg/天(标准剂量为600mg/天)时，症状得到缓解⁵。

根据最新研究，另一个重要原因是EFV即使在临床浓度仍然能诱导细胞凋亡。EFV能降低线粒体膜通透性、提高过氧化物等的产生、导致线粒体质量提高；EFV抑制O₂消耗，降低细胞内ATP的水平；EFV诱导细胞自吞。寻找线粒体凋亡过程中的变化分子，将能为EFV肝毒性的预警提供标识分子。

发明内容

本发明的目的在于提供依非韦伦肝细胞毒性分子标志物及其应用，具体涉及D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测肝细胞毒性分子标志物中的用途。

本发明通过蛋白质组学的方法在依非韦伦(EFV)肝细胞毒性模型中发现NADH脱氢酶为与肝毒性成正相关的蛋白质，经定量PCR和免疫印迹实验从mRNA和蛋白质的水平验证了该蛋白质的表达。本发明实验结果显示，D-3-磷酸甘油脱氢酶可用作检测EFV肝细胞毒性的分子标志。

本发明通过建立肝毒性的细胞模型，利用蛋白质组学方法筛选在依非韦伦EFV处理致线粒体毒性和未经处理的肝细胞中差异表达的蛋白质，结果显示了与肝细胞毒性正相关的蛋白质(在EFV处理组中高表达)，经质谱鉴定确定为D-3-磷酸甘油脱氢酶；进一步的荧光定量PCR和免疫印迹实验证实，该蛋白质在不同浓度的EFV处理组中均比未经处理的高表达，且该D-3-磷酸甘油脱氢酶与EFV肝细胞毒性呈正相关。本发明结果表明，以该蛋白质的转录本作为一个分子标志对其转录水平进行定量检测可用作检测EFV肝细胞毒性。

本发明的另一个目的在于提供D-3-磷酸甘油脱氢酶特异性的引物与抗体(包括单克隆抗体和多克隆抗体)，用于制备检测EFV肝细胞毒性制剂。

本发明的再一个目的在于提供一种D-3-磷酸甘油脱氢酶的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备检测EFV肝细胞毒性的试剂盒。

本发明的进一步目的在于提供一种体外检测EFV肝细胞毒性细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶表达是否异常的方法，该方法包括以下步骤：

A、用特异性抗体或者定量PCR技术检测待检肝细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶的数量；